LncRNA TUG1在糖尿病肾病患者中的表达及临床意义

陈昕彦 于 萌 李 湘 许静宜 林奕辰 刘晓丹 王 璐

作者单位： 116000 辽宁大连 大连大学附属中山医院骨质疏松科

2型糖尿病(type 2 diabetic mellitus, T2DM)是一种糖代谢紊乱的疾病，可引发T2DM肾病，若不积极治疗，可发生肾纤维化，导致死亡[1-2]。因此，寻找与T2DM肾病发病相关的因素，及时干预，改善T2DM肾病患者生存状况有积极意义。既往研究[3-4]显示，T2DM肾病发病与微小RNA(microRNA, miRNA)、氧化应激、糖代谢紊乱、长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)等相关。研究[5]发现，LncRNA牛磺酸上调基因1(LncRNA taurine up-regulated gene 1，LncRNA TUG1)在T2DM肾病中表达呈低表达，其可能通过抑制微小RNA-21(microRNA-21, miR-21)表达，进而影响T2DM肾病病理发展。秦凤等[6]研究显示，miR-21在T2DM肾病患者中呈高表达，其可作为评估T2DM肾病患者病情严重程度的辅助指标。但LncRNA TUG1在T2DM肾病患者中的表达水平及其与miR-21的相关性尚不明确。因此，本文通过测定LncRNA TUG1在T2DM肾病患者血清中的表达水平，旨在分析LncRNA TUG1与miR-21表达水平的相关性及其诊断T2DM肾病的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年1月至2020年8月大连大学附属中山医院收治的82例T2DM肾病患者为T2DM肾病组，男性42例，女性40例，年龄41～79岁，平均(61.65±12.73)岁。另选取同期T2DM无肾病患者80例为单纯T2DM组，男性39例，女性41例，年龄41～80岁，平均(62.04±12.91)岁。纳入同期体检健康者82例为健康组，男性43例，女性39例，年龄40～79岁，平均(59.72±12.56)岁。单纯T2DM组患者纳入标准：①患者符合《中国2型糖尿病防治指南(2013年版)》[7]中T2DM的诊断标准；②不伴有肾病。T2DM肾病组患者纳入标准：①患者符合《糖尿病肾病防治专家共识(2014年版)》中T2DM肾病的判定标准[8]，经实验室检查确诊；②患T2DM时间>5年。单纯T2DM组、T2DM肾病组患者排除标准：①患有I型糖尿病者；②妊娠患者；③有透析、肾移植、膜性肾病史者；④有免疫球蛋白A肾病、高血压肾病或其他原发性/继发性肾病者；⑤临床资料不齐全者；⑥合并脑血管、心、肝功能异常者；⑦合并甲状腺疾病、肿瘤、感染性疾病者；⑧出现血尿者。受试者对本研究知情同意。本研究符合《赫尔辛基宣言》，经本院伦理委员会批准(批号：20180117)。

1.2 方法

1.2.1 样本收集 收集受试者空腹外周静脉血3～5 mL，自然凝集28～32 min，分离血清(4 500 r/min离心6 min，离心半径为8 cm)，分装，于-70℃冰箱储存。

1.2.2 实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法检测血清LncRNA TUG1、miR-21表达水平 冰上解冻血清样本，利用TRIzol Reagent(15596018，美国GIBCO公司)获取血清样本总RNA；按High Capacity RNA-to-cDNA Kit(4489328C，美国Thermo公司)说明书合成cDNA；最后，利用SYBR Green Realtime PCR Master Mix(XY-TYB-QPK-201，日本Cosmo Bio公司)、qRT-PCR仪(StepOne TM，美国ABI公司)扩增cDNA，获得循环阈值(CT值)。qRT-PCR仪参数：97.8℃ 8 min，95℃ 40 s，58.5℃ 20 s，62℃ 15 s，40个循环。LncRNA TUG1以GAPDH为内参，miR-21以U6为内参，引物序列见表1。LncRNA TUG1、miR-21相对表达量以2-ΔΔCT法计算。

表1 LncRNA TUG1、GAPDH、miR-21、U6引物序列

1.2.3 观察指标 ①比较3组研究对象临床资料(年龄、性别构成比等)、收集3组对象糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin, HbA1c)、估计肾小球滤过率(estimated glomeruar filtration rate, eGFR)、身体质量指数(body mass index, BMI)、血清肌酐(serum creatinine, SCr)、空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)、蛋白尿等资料，及血清LncRNA TUG1、miR-21水平；②分析血清LncRNA TUG1对T2DM肾病的诊断价值。

2 结果

2.1 3组对象一般资料比较 与健康组相比，单纯T2DM组、T2DM肾病组患者HbA1c、SCr、FBG、蛋白尿水平升高(P<0.05)，eGFR水平降低(P<0.05)；与单纯T2DM组相比，T2DM肾病组患者SCr、蛋白尿水平升高(P<0.05)，eGFR水平降低(P<0.05)。3组对象年龄、BMI、性别差异无统计学意义(P>0.05)，基线资料可比。见表2。

表2 3组对象一般资料比较

2.2 3组对象血清LncRNA TUG1、miR-21表达水平比较 与健康组相比，单纯T2DM组、T2DM肾病组患者血清LncRNA TUG1表达水平降低(P<0.05)，血清miR-21表达水平升高(P<0.05)；与单纯T2DM组相比，T2DM肾病组患者血清LncRNA TUG1表达水平降低(P<0.05)，血清miR-21表达水平升高(P<0.05)。见表3。

表3 3组对象血清LncRNA TUG1、miR-21表达水平比较

2.3 T2DM肾病患者血清LncRNA TUG1、miR-21表达水平与HbA1c、eGFR、SCr、FBG、蛋白尿的相关性 Pearson相关性分析显示，T2DM肾病患者血清LncRNA TUG1表达水平与HbA1c、SCr、FBG、蛋白尿呈负相关(P<0.05)，与eGFR呈正相关(P<0.05)；T2DM肾病患者血清miR-21表达水平与HbA1c、SCr、FBG、蛋白尿呈正相关(P<0.05)，与eGFR呈负相关(P<0.05)。见表4。

表4 T2DM肾病患者血清LncRNA TUG1、miR-21表达水平与HbA1c、eGFR、SCr、FBG、蛋白尿的相关性

2.4 T2DM肾病患者血清LncRNA TUG1表达水平与miR-21的相关性 Pearson相关法分析显示，T2DM肾病患者血清LncRNA TUG1表达水平与miR-21呈负相关(r=-0.587，P<0.05)。见图1。

图1 T2DM肾病患者血清LncRNA TUG1表达水平与miR-21的相关性(n=82)

2.5 血清LncRNA TUG1水平对T2DM肾病的诊断价值 以血清LncRNA TUG1为检验变量，以 T2DM肾病是否发生为状态变量，绘制ROC曲线，结果显示，血清LncRNA TUG1诊断T2DM肾病的曲线下面积(area under curve，AUC)为0.871(95%CI:0.812～0.930)，截断值为0.63，约登指数为0.695，其灵敏度为81.7%，特异度为87.8%。见图2。

图2 血清LncRNA TUG1诊断T2DM肾病的ROC曲线

3 讨论

T2DM肾病是T2DM的一种并发症，其以肾小球硬化为特征，可出现蛋白尿，严重损害患者身心健康[9-10]。因此，积极探讨T2DM肾病的发病机制，有利于寻找诊断T2DM肾病的标志物及治疗靶点。

LncRNA是一类非编码RNA分子，长度约为200 nt，其可调控氧化应激，调节上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，介导自噬，影响信号转导，参与内质网应激过程，与T2DM、高血压、T2DM肾病等关系密切[11-12]。研究[13]发现，LncRNA TUG1在T2DM肾病中表达失调，其可能通过影响内质网应激反应，进而影响肾上皮细胞损伤，LncRNA TUG1具有诊断T2DM肾病的潜在价值。Meng等[14]研究发现LncRNA TUG1可能通过影响相关信号通路，抑制肾小管上皮细胞凋亡，从而改善T2DM肾病病变进程，IncRNA TUG1可能是治疗T2DM肾病的潜在靶标。本研究中,T2DM肾病患者血清LncRNA TUG1表达水平低于单纯T2DM患者及健康者，与Meng等[14]研究趋势一致，提示LncRNA TUG1可能与T2DM肾病病理过程密切相关，推测LncRNA TUG1可能通过影响相关信号转导，调节内质网应激反应，进而影响T2DM肾病发生发展，其机制仍需深入探讨。本研究显示，T2DM肾病患者HbA1c、SCr、FBG、蛋白尿水平高于健康者，SCr、蛋白尿水平高于单纯T2DM患者，eGFR水平低于单纯T2DM患者及健康者，提示T2DM肾病患者存在血糖紊乱及肾损伤。进一步研究发现，T2DM肾病患者血清LncRNA TUG1表达水平与HbA1c、SCr、FBG、蛋白尿呈负相关，与eGFR呈正相关，提示LncRNA TUG1可能与血糖、肾功能共同影响T2DM肾病病变过程。此外，本文还利用ROC曲线分析了血清LncRNA TUG1诊断T2DM肾病的价值，结果显示，血清LncRNA TUG1诊断T2DM肾病的AUC为0.871，当血清LncRNA TUG1相对表达量<0.63时，T2DM肾病发生概率较大，提示LncRNA TUG1对T2DM肾病有一定诊断价值，测定血清LncRNA TUG1水平有助于临床诊断T2DM肾病。

miRNA是一类非编码RNA小分子，可参与信号转导，影响内质网应激，调节氧化应激过程，与T2DM、糖尿病视网膜病变、T2DM肾病等有关[15-16]。研究[17]发现，miR-21作为miRNA的一员，其在T2DM肾病中呈高表达，下调miR-21可抑制T2DM肾病的发展及肾纤维化，miR-21可能是治疗T2DM肾病的潜在靶标；另外，miR-21在T2DM肾脏疾病患者中表达水平较高，其可能在T2DM肾脏疾病患者发生肾纤维化过程中起促进作用[18]。本文中，T2DM肾病患者血清miR-21表达水平高于单纯T2DM患者、健康者，与秦凤等[6]研究趋势相符，提示miR-21可能参与T2DM肾病病理变化，分析原因，miR-21作为miRNA的成员之一，其可能通过调节氧化应激，影响相关信号转导过程，进而在T2DM肾病中起促进作用，但其机制有待进一步研究。另外，本研究显示，T2DM肾病患者血清miR-21表达水平与HbA1c、SCr、FBG、蛋白尿呈正相关，与eGFR呈负相关，提示miR-21可能与血糖、肾功能协同影响T2DM肾病病理发展。此外，本文还分析了T2DM肾病患者血清LncRNA TUG1表达水平与miR-21的相关性，结果显示，LncRNA TUG1表达水平与miR-21呈负相关，提示LncRNA TUG1可能与miR-21共同影响T2DM肾病发生发展，但具体机制需结合基础研究加以证实。

综上所述，T2DM肾病患者血清LncRNA TUG1表达水平较低，其与miR-21、HbA1c、eGFR、SCr、FBG、蛋白尿显著有关，LncRNA TUG1可能是诊治T2DM肾病的分子靶标。但本研究未深入探讨LncRNA TUG1、miR-21在T2DM肾病中的机制，样本较少，且未分析miR-21诊断T2DM肾病的价值，后期将从多角度进行深入研究，为临床诊治T2DM肾病提供更有力参考。