黏质沙雷氏菌Ha1菌株复合菌剂除草效果评价

田 赐， 马树杰， 张利辉， 董金皋

(华北作物改良与调控国家重点实验室/河北农业大学植物保护学院，河北保定 071001)

玉米(Zeamays)是全球产量最大、用途最广的作物，然而田间杂草的存在会引起玉米田产量降低，经济效益下降[1-3]。化学除草剂虽快速防除了杂草，解决了其对玉米田间的危害，但随着单一品种的大量使用，一系列的问题也随之产生，例如抗性提高，水质、土壤的污染，人畜中毒等[4-6]。在农业生产中，通常利用除草剂与增效助剂复配和研发天然源除草剂等措施来减少化学除草剂在田间产生的负面作用。其中，如何有效地将除草剂减量使用并达到增效作用是实现玉米田杂草绿色防控和安全生产的主要研究方向[7-8]。

微生物农药因对人类和环境安全、不易产生抗性以及可改造性强等优点，在有害生物防治中具有良好的发展潜力[9]。微生物农药虽有众多优点，但也存在防治效果慢、防治范围窄、稳定性较差等缺点[10-11]。为了扩大微生物的杀草谱，可以将2种或2种以上具有抑制杂草活性的菌株混合在一起，进行复合菌剂的制作，针对性解决微生物农药防治范围窄、对环境的适应性差等问题。研究发现，塔宾曲霉属菌株Z-5和黑曲霉属菌株Z-6复配后，对马唐、苘麻、鹅头稗和马齿苋达到80%的防除效果[12]。还可以将微生物除草剂与化学除草剂进行复配研究，如不同浓度精吡氟禾草灵和阿特拉津与菌株分生孢子混配的防效明显高于单独使用时对马唐杂草的防除效果[13]。

黏质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)属于肠杆菌科，具有很高的生物活性，其活体菌株对鳞翅目害虫甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)和半翅目害虫褐飞虱(NilaparvatalugensStal)具有一定毒力作用，并已被列为黄胫小车蝗(Oedaleusinfernalis)的生防菌，黄胫小车蝗感染黏质沙雷氏菌4 d后的死亡率达87%[14-16]。黏质沙雷氏菌还具有较高的除草活性，其粗提物对马唐和莱茵衣藻具有较强的抑制活性，活体菌剂与化学除草剂复配对马唐的抑制率达63.12%[17-18]；此外，黏质沙雷氏菌代谢产物灵菌红素可以抑制多种细菌及真菌，如铜绿假单胞菌、小双胞腔菌等，有望被开发作为新型杀菌剂[19]。综合多方面农用活性来看，黏质沙雷氏菌具有良好的应用前景。本研究利用黏质沙雷氏菌Ha1菌株与死谷芽孢杆菌(Bacillusvallismortis)07-1菌株进行复合菌剂制作，按照国家标准规定对复合菌剂检测后将其与玉米田化学除草剂减量复配使用，结合2种菌株复合发酵液以及与化学除草剂复配的田间试验效果，筛选出最优的复配措施，以期为玉米田除草剂的减量增产提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试杂草 主要试验杂草有反枝苋(Amaranthusretroflexus)、稗(Echinochloacrusgalli)。

1.1.2 供试菌株 主要菌株有黏质沙雷氏菌(S.marcescens)Ha1菌株、死谷芽孢杆菌(B.vallismortis)07-1菌株。

1.1.3 供试药剂 主要试剂有蛋白胨、琼脂、酵母粉、蔗糖(北京索莱宝科技有限公司)、高岭土、粗面粉、50%莠去津悬浮剂(山东滨农科技有限公司)、10%烟嘧磺隆可分散油悬浮剂(山东奥坤作物科学股份有限公司)、40%乙·莠悬乳剂(乙草胺21.1%，莠去津18.9%)(济南天邦化工有限公司)、26%烟·莠可分散油悬浮剂(烟嘧磺隆4%，莠去津22%)(德州祥龙生化有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 Ha1菌株复合菌剂制作 Ha1菌株和07-1菌株最适稀释梯度的筛选(以Ha1菌株为例)：Ha1菌株在摇床(20 ℃，200 r/min)培养24 h后取出，吸取100 μL菌悬液加入到900 μL无菌水中，摇匀，即为10-1菌悬液；从10-1菌悬液中吸取100 μL加入到900 μL的无菌水中，为10-2菌悬液，以此类推，直至稀释到10-10。从10-6、10-7、10-8、10-9、10-10菌悬液中分别吸取100 μL菌悬液进行涂板，培养48 h后查看菌株生长情况，能数出单菌落时的稀释倍数为最适倍数，每个处理重复3次。筛选结果显示，Ha1菌株最佳稀释梯度为10-8，07-1菌株最佳稀释梯度为10-7。

选用高岭土和粗面粉为颗粒剂的载体，两者的体积比为2 ∶1，稀释好的Ha1菌株与07-1菌株加入适量的高岭土与粗面粉混合物，于造粒机中造粒，颗粒置于通风良好处风干，备用。

配制好的Ha1菌株与07-1菌株复合颗粒剂根据GB 20287—2006《农用微生物菌剂》测定颗粒剂有效活菌数及杂菌数、水分含量和pH值[18，20]。

1.2.2 Ha1菌株复合菌剂除草活性及安全性测定 苗前处理：将蛭石 ∶营养土 ∶草木灰按体积比2 ∶1 ∶1混合，装入长宽高为7 cm×7 cm×10 cm的塑料花盆，将其放入45 cm×30 cm的周转箱中自然吸水，塑料花盆中土壤完全湿润后，挑选饱满露白一致的杂草种子均匀播种于花盆中，表层覆盖 0.3～0.5 cm的营养介质，然后分别撒入7.74×109、15.48×109、3.09×1010、6.19×1010、12.38×1010CFU/g的Ha1菌株与07-1菌株复合菌剂，同时设置阳性对照莠去津(田间推荐剂量为 0.45 mL/m2)和空白对照，每个处理4次重复。置温室(温度28 ℃，湿度40%，光照12 h)进行培养，7 d 后测定杂草地上部鲜质量，计算抑制率。鲜质量抑制率=(对照组杂草鲜质量-处理组残存杂草鲜质量)/对照组杂草鲜质量×100%。

苗后处理：待杂草长至3～4叶期，将颗粒剂均匀撒到土层表面，使用剂量及处理同苗前处理，设置阳性对照烟嘧磺隆(田间推荐剂量为 0.06 mL/m2)及空白对照，每个处理4次重复，7 d 后测定杂草地上部鲜质量，并计算抑制率。

Ha1菌株与07-1菌株颗粒剂对玉米的安全性测定：在每个塑料花盆中种植5棵露白的玉米种子，将Ha1菌株复合菌剂3.09×1010CFU/m2均匀撒在土壤表面，温室(温度28 ℃，湿度40%，光照12 h)生长7 d后测定玉米发芽生长情况；玉米在塑料花盆中长至3～5叶期时，进行Ha1菌株复合菌剂的撒施处理，设置清水为空白对照，每个处理4次重复，在温室生长7 d后测定颗粒剂对玉米地上部生长的影响。

1.2.3 化学除草剂对Ha1菌株及07-1菌株生长的影响 测定除草剂40%乙·莠悬乳剂和26%烟·莠可分散油悬浮剂与Ha1菌株和07-1菌株的相容性。将40%乙·莠悬乳剂和26%烟·莠可分散油悬浮剂分别加入到150 mL灭菌的LB液体培养基中，分别配制成0.6 mL/m2和0.15 mL/m2(推荐剂量)，2种菌株的接入量均为100 μL，具体处理如表1。

表1 除草剂与菌株相容性试验设计

按照表1配制好各处理后，将Ha1菌株的处理放入20 ℃摇床，07-1菌株放入37 ℃摇床，在48、72、96、120、144 h将菌悬液取出，各处理稀释至10-8、10-9、10-10涂板，每个处理3次重复，24 h后观察单菌落，查看菌株繁殖状况。

1.2.4 Ha1菌株复合菌剂与化学除草剂复配室内除草活性测定 在明确除草剂对菌株生长无抑制作用后，将40%乙·莠悬乳剂和26%烟·莠可分散油悬浮剂分别进行全量、减量30%与Ha1菌株复合菌剂1.95×1010CFU/m2复配以及空白对照试验，每个处理4次重复。

1.2.5 Ha1菌株复合菌剂与化学除草剂复配后对玉米的安全性 40%乙·莠悬乳剂田间推荐剂量0.60 mL/m2、40%乙·莠悬乳剂(减量30%) 0.42 mL/m2+Ha1菌株复合菌剂1.95×1010CFU/m2、26%烟·莠0.15 mL/m2、26%烟·莠(减量30%)0.10 mL/m2+Ha1菌株复合菌剂 1.95×1010CFU/m2及清水对照，每个处理4次重复，7 d后调查玉米地上部鲜质量，计算抑制率，测定方法与公式同“1.2.2”节。

1.2.6 田间小区试验设计 2021年4—11月在河北省保定市徐水区高林营村进行田间试验。根据GB/T 17980.41—2000《农药田间药效试验准则》采用随机区组设计；小区面积为27 m2，每个处理重复4次，玉米品种为郑单958，喷药量为30 L/667 m2，苗前在种植玉米后进行处理，苗后在玉米3～5叶期时处理，详细试验处理见表2、表3。

表2 Ha1菌株复合菌剂与苗前除草剂玉米田减量试验设计

1.2.7 田间试验调查 根据GB/T 17980.41—2000《农药田间药效试验准则》进行田间杂草防效调查，分别在施药后7、14、28 d取样调查株数，14、28 d时调查杂草地上部鲜质量；采用棋盘式取样法，每个小区取样4个点(每个样点0.25 m2)。防治测产时，每个小区取中部2行玉米，每行20株，调查穗行数、行粒数，计算穗粒数、小区有效穗数；根据公式计算乘以缩值系数0.85的产量：产量(kg/667 m2)=小区有效穗数(穗/667 m2)×穗粒数(粒/穗)×百粒质量(g)÷100×0.85。

表3 Ha1菌株复合菌剂与苗后除草剂玉米田减量试验设计

1.3 数据处理及分析

利用Excel对试验数据进行处理，SPSS 19.0软件进行邓肯氏新复极差(DMRT)法进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 Ha1菌株复合菌剂研究

由表4可知，Ha1菌株与07-1菌株的颗粒剂中有效活菌数为38.7×107CFU/g，杂菌率为3.1%，pH值为6.56，水分含量为4.2%，所测指标均处于国家标准规定范围之内，符合复合菌剂制作标准。

表4 Ha1菌株复合菌剂生物特性测定

2.2 Ha1菌株复合菌剂室内除草活性研究

Ha1菌株复合菌剂的不同施药剂量对苗前、苗后的稗和反枝苋地上部鲜质量试验结果(表5)表明，在施用量为12.38×1010CFU/g时，颗粒剂对稗苗前、苗后的鲜质量抑制率分别为66.74%、75.00%；而在试验过程中，由于反枝苋长势较弱，需采取移栽的方法进行试验，故对反枝苋仅进行了苗后处理，同施用量下反枝苋的鲜质量抑制率达66.05%。

表5 不同施药剂量Ha1菌株复配颗粒剂对杂草苗前和苗后的室内抑制效果

2.3 化学除草剂对Ha1菌株及07-1菌株的影响

测定2种化学除草剂处理后144 h内对Ha1菌株与07-1菌株的生长影响，由图1、图2可知，化学除草剂26%乙·莠悬乳剂和40%烟·莠可分散油悬浮剂对2种菌株的生长均未产生抑制作用，调查结果表明，同一生长期2种菌株的活菌数均低于添加除草剂的处理，在144 h时，添加乙·莠的处理中，Ha1菌株和07-1菌株的活菌数都达到最高，分别为2.16×1012、1.63×1012CFU/mL，复配后2种菌株和除草剂的相容性良好，可以将2种化学除草剂与2种菌株复配进行田间除草试验研究。

2.4 Ha1菌株复合菌剂与化学除草剂复配室内除草活性测定及对玉米安全性测定

Ha1菌株复合菌剂与2种化学除草剂推荐剂量复配后室内除草活性测定中，除了空白对照外，所有处理组杂草全部死亡，抑制率达100%。同样的处理对玉米进行安全性测定后，结果如表6所示，4种处理对玉米的鲜质量并未产生抑制效果，抑制率均在0以下，可以应用到大田试验。

表6 化学除草剂与Ha1菌株复合颗粒剂复配对玉米安全性测定结果

2.5 Ha1菌株复合菌剂与化学除草剂复配对田间杂草防效

田间试验结果表明，苗前处理中40%乙·莠悬乳剂与Ha1菌株复合菌剂复配处理对杂草28 d的株数和鲜质量防效分别为80.65%、98.02%，玉米产量为440.71 kg/667 m2，与对照区玉米产量相比增产6.70%。苗后田间处理中26%烟·莠可分散油悬浮剂与Ha1复合颗粒剂复配的处理对田间杂草14 d的鲜质量防效为98.62%，28 d的株数与鲜质量防效分别是85.16%和99.59%，产量为 486.93 kg/667 m2，较对照区的玉米产量提高了17.93%(表7)。

3 结论与讨论

杂草与作物竞争水分、光照和养分，是造成农田产量损失的主要生物因素[21-24]。化学除草剂的不规范使用是导致杂草抗性、药害等问题产生的主要原因，怎样有效解决化学除草剂带来的负面问题备受大众关注，开发新型天然除草剂是当下主要任务，通过添加增效助剂来实现化学除草剂减量增效是农田常用的农业生产措施[25-27]。据研究，添加红太阳A8助剂后的异丙隆药液防除菵草时90%有效剂量(ED90)降低626.3 g/hm2；除草剂50%丙炔氟草胺可湿性粉剂和33%二甲戊灵乳油用量减量20%后添加激健、安融乐、增效王等3种喷雾助剂，发现棉田杂草防除效果与常规用量相当，且对棉花生长发育安全[28-29]。

表7 Ha1菌株复合颗粒剂与除草剂减量复配对田间杂草防效

微生物复合菌剂具有比单菌株更能够长期发挥作用、效果稳定并增加作物产量等诸多优势[30-31]。在杨杰等的研究中，利用棉花内生真菌进行了复合菌剂的制作，对棉花黄萎病进行防效调查，结果表明6月中旬前后将该配方以30 kg/hm2用量分2次等量随水滴施，对棉花黄萎病的防治效果较好，并有增产提质效果[32]；用2株无拮抗作用的放线菌菌株的复合菌剂研究对番茄青枯病的防治效果，发现复合发酵液的抑菌率明显高于单一菌株，盆栽防效达82.03%，干质量增加76.58%，有望进行菌肥的开发利用[33]。

黏质沙雷氏菌在自然界中广泛存在，在土壤、海洋和动植物中均可分离获得，菌株除了具有抗炎、杀菌和杀虫活性外，还表现出了一定的除草活性[34-35，19]。本研究制备的Ha1菌株与07-1菌株复合颗粒剂生物特性符合国家标准，且与玉米田常用化学除草剂复配后，均优于复合菌剂对玉米田杂草的防效。据实验室前期研究，黏质沙雷氏菌Ha1菌株制备的颗粒剂对玉米田杂草有较好的防效，可达76.82%[17，36]，本研究结果与之相符，均显示了Ha1菌株较高的除草活性。化学除草剂的种类较多，不同除草剂与菌剂混用有不同的除草效果，而Ha1菌株复合菌剂与各类不同除草剂的复配效果，可以开展相关试验对其进一步研究。