呕吐毒素检测测量系统分析

韦 冰，陈艳熙，覃均生

（南宁学院，广西南宁 541699）

呕吐毒素是禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌等真菌的次生代谢物，过量摄入会激发呕吐、腹泻、肠胃不适、抑制免疫系统等毒性效应。多个物种尤其猪对其毒性非常敏感。对生长育肥猪而言，当饲料中含有12～14 mg/kg 呕吐毒素，进食后10～20 min 即会使猪出现呕吐、不正常的焦虑、磨牙现象，当食物中呕吐毒素含量超过19 mg/kg，猪拒绝采食（黄凯等，2013）。国标GB 13078—2017《饲料卫生标准》规定，植物性饲料原料中呕吐毒素限量≤5 mg/kg。近年来的研究表明，人类患IgA 肾病和呕吐毒素摄入有关（张海涛等，2021）。因此，不论是饲料原料还是饲料成品，呕吐毒素含量都是养殖行业的必检项目。

根据GB13078—2017，饲料原料、成品均应按照GB/T 30956—2014《饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定 免疫亲和柱净化—高效液相色谱法》中介绍的高效液相色谱法进行检测。该检测方法的准确性和可靠性毋庸置疑，但该方法检测成本高，检测时间为2～4 h（时间过长），试验操作对实验人员的素质要求高等缺点都不适宜在企业进行频繁、大批量的样品检测。

随着研究的深入和科技的发展，呕吐毒素检测方法也在不断更迭换代。罗俊聪和李浩坤（2014）将ELISA 试剂盒法与高效液相色谱法进行对比，发现两者的回收率相差不大，且ELISA试剂盒法要比高效液相色谱法样品前处理时间更短、检测时间更短、试验成本更低等优势。李小明等（2017）将便携式真菌毒素快速定量检测仪和酶联免疫法用于检测玉米中的呕吐毒素含量，以得到快速定量检测仪的检出限。何咏怡等（2021）为了解市售呕吐毒素酶联免疫吸附试剂盒质量情况，选取了两款市售呕吐毒素酶联免疫吸附试剂盒进行性能研究，结果表明，两款试剂盒的检出限、量限、回收率、复性和一致性均能满足国内对玉米中呕吐毒素的检测要求。

以上现有研究均是对检测呕吐毒素测量方法的性能进行对比分析，但对检测呕吐毒素测量系统分析的研究尚未有报道。测量系统是指得到测量结果过程中所有操作人员、测量仪器、设备、环境、软件等因素。而测量系统分析则是测量系统评估工具。测量系统分析被广泛应用于汽车制造等领域（孙国峰等，2022；郑晓峰等，2022；张娅岚等，2021；马丽莎，2021；潘涛等，2021；韦永寅，2021；王海龙等，2020；陶明东和周梦璐，2020；Muhammad 等，2020），用以确保测量数据的质量。本研究对饲料企业常用的两种检测呕吐毒素方法-ELISA 试剂盒法和上转发光法的测量系统进行分析（样品前处理使用的电子分析天平、粉碎机、振荡器、离心机均为相同仪器），一方面，为了检测现阶段测量数据的可靠性，另一方面，通过对比分析选择其中更为合适的检测方法，为相关企业选择检测呕吐毒素方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 某饲料生产公司购入的转基因玉米[ 呕吐毒素含量要求（0.22±0.03）mg/kg、高粱（0.46±0.03）mg/kg、进口玉米（0.87±0.03）mg/kg、玉米蛋白粉（1.90±0.03）mg/kg、国产安徽玉米（2.20±0.03）mg/kg]等植物性饲料原料，经过粉碎、振荡及离心后的待测液。

水为GB/T 6682 规定的二级水。

1.2 仪器与设备 食品安全快速检测仪：北京热景生物技术股份有限公司制造，仪器型号为UPT-3A-1800-5，生产日期为2021年8月26日（仪器有效使用期限为5年），输入电源条件为100—240VAC、50/60 Hz、1.0 A。

定量条：北京热景生物技术股份有限公司生产，批号为20211003，实验中使用的定量条均为同一生产厂家、同一生产批号，与食品安全快速检测仪配套使用。

酶联竞争免疫分析仪：赛默飞世尔（上海）仪器公司的Multiskan FC 型酶标仪，最大输入功率为100 VA。

试剂盒：河北伊莱莎生物技术有限公司生产，生产批号为20018H-2，试验中使用的试剂盒均为同一生产厂家、同一生产批号。

数据分析软件采用Minitab 18。

1.3 试验方法

1.3.1 上转发光法 （1）对样品进行前处理。粉碎样品（样品粉碎程度达到90% 过30 目筛），称量（2±0.2）g 粉碎后的样品于50 mL 离心管中，加入20 mL 蒸馏水，放入振荡器中振荡15 min，取出离心管并转移至离心机中离心5 min，小心取出，勿使溶液浑浊。

（2）确认当前检测环境温度为20～25℃，移取700µL 样本稀释液于2 mL 小离心管中。

（3）移取100µL 样液于已有草本稀释液的小离心管中，混匀，为待测液。

（4）使用移液枪吸取待测液100µL 于定量条的反应孔中，等待反应15 min。

（5）使用食品安全快速检测仪读取定量条中的一维码后，将定量条插入食品安全快速检测仪口中，食品安全快速检测仪进行读数并输出结果。

1.3.2 ELISA 试剂盒法 （1）对样品进行前处理。粉碎样品（样品粉碎程度达到90% 过30 目筛），称量（2±0.2）g 粉碎后的样品于50 mL 离心管中，加入20 mL 蒸馏水，放入振荡器中振荡15 min，取出离心管并转移至离心机中，离心5 min，小心取出，勿使溶液浑浊。

（2）试剂盒回温后将100µL 酶标记物加入到混合孔中。

（3）将50µL 标准品或样品分别加入每个混合孔中，混匀，用移液枪吸取100µL 混合孔中的液体转移至对应的试验孔中（酶标板），注意防止污染。

（4）20～25℃的温度下反应10 min。

（5）清洗液洗板。

（6）在每个试验孔中加入100µL 底物溶液，使其显色后，在20～25℃的环境下再反应5 min。

（7）在每个试验孔中加入100µL 终止液，延缓试验孔中溶液的反应速度。

（8）使用450 nm 酶标仪读取吸光度值，在小蜜蜂软件中输入对应吸光度值，输出结果。

1.3.3 测量系统分析方法 上转发光法和ELISA试剂盒法两个测量系统的分辨力、稳定性、偏倚、线性、重复性和再现性研究方案设计要点如表1所示。

表1 两个测量系统分析方案设计要点

2 结果与分析

2.1 分辨力 可接受的分辨力应小于制造过程变差或公差的十分之一（杨朝盛，2020；克莱斯勒集团公司等，2010；吕莹，2017）。

酶标仪的测量分辨力为0.00001 mg/kg，食品安全快速检测仪的测量分辨力为0.01 mg/kg。根据以往试验，饲料原料呕吐毒素含量为0.2～2.5 mg/kg，表明这两个测量系统的分辨力都满足检测要求。相比而言，ELISA 试剂盒法的分辨力更优于上转发光分析法。

2.2 稳定性 稳定性是测量系统分析的前提条件之一。本研究采用均值- 极差控制图分别对ELISA 试剂盒法、上转发光分析法测量系统进行稳定性分析，结果如图1所示。

极差图和均值图均无异常点，处于统计受控状态。因此，ELISA 试剂盒法、上转发光分析法测量系统稳定性可以接受。

2.3 偏倚和线性 为提高试验数据的使用率，降低试验成本，将偏倚和线性进行联合分析和讨论。两种方法的测量系统线性、偏倚分析结果如图2、图3所示。

由图2可知，“偏倚=0”线被95% 的置信区间完全包含，P（斜率）=0.511＞0.05，P（常量）=0.7＞0.05，表明ELISA 试剂盒法测量系统不存在显著线性差异。同时，P（平均偏倚）=0.115＞0.05，表明该测量系统不存在显著偏倚误差。同理，由图3可知，上转发光法测量系统线性和偏倚均在可接受范围。

2.4 重复性和再现性 重复性和再现性实质分别反映的是设备变差和人变差。重复性和再现性通常联合分析也称为测量系统R&R 分析。ELISA 试剂盒法测量系统分析Minitab 输出结果如表2、表3所示。

表2 ELISA 试剂盒法双因子方差分析表

表3 ELISA 试剂盒法研究变异分析表

由表2、表3可知，ELISA 试剂盒法方差分析表，部件P 值小于0.05，是唯一影响测量误差的显著因子。研究变异分析表中，合计量具R&R 的“%研究变异（%SV）”即R&R% 为6.56%，“% 公差”即P/T% 为5.48%，均小于10%，表明该测量系统测量误差在可接受范围内。

由表4、图4可知，上转发光法合计量具R&R% 为37.12%，P/T% 为96.08%，均 大 于30%，同时可区分的类别数只有3，表明测量误差过大，该测量系统不可接受。

表4 上转发光法研究变异分析表

3 讨论及结论

在ELISA 试剂盒法和上转发光法测量系统分析中，分辨力、稳定性、偏倚和线性均满足要求。但后者重复性和再现性（R&R%和P/T%）不可接受。主要原因在于上转发光法所使用的食品安全快速检测仪可视分辨力仅为0.01 mg/kg。其满足“十分之一”法则，是基于常见多种饲料原料呕吐毒素含量范围（0.2～2.5 mg/kg）之上。但对于某种常用饲料原料，如转基因玉米（0.22±0.03 mg/kg）、高粱（0.46±0.03 mg/kg）、进口玉米（0.87±0.03 mg/kg）、玉米蛋白粉（1.90±0.03 mg/kg）、国产安徽玉米（2.20±0.03 mg/kg）等，公差为0.06 mg/kg，食品安全快速检测仪可视分辨力不符合十分之一法则要求。同时，在上转发光法测量系统R&R 分析中，可区分的类别数NDC 不足5，即1.41σAct/σR&R＜5；均值控制图未有50%以上的点超上下控制界限，R 图极差个数仅有2 个，以上均表明了该方法的测量系统有效分辨力不足。

综上研究，ELISA 试剂盒法测量系统误差在可接受范围内，测量数据相对准确、可靠。相比于上转发光法，建议相关企业优先选择ELISA 试剂盒法。

测量系统分析不仅能降低因测量不可靠导致的品质风险，避免成本浪费，还可提高顾客对组织的信任，提高客户对品牌的信心。这也是测量系统分析目前能在越来越多领域得到深入推广应用的原因。本研究将测量系统分析应用于饲料原料呕吐毒素检测中，丰富了测量系统分析的使用范围，也为相关企业选择呕吐毒素检测方法提供了参考。