山西老陈醋沉淀物中川芎嗪检测方法分析研究

王涛

（山西省食品研究所（有限公司），山西太原 030024）

山西老陈醋是中国四大名醋之一，其生产至今已有3 000 余年的历史，素有“天下第一醋”的盛誉。山西老陈醋是以谷物为原料，经过液化、糖化、发酵、陈酿等工艺制得。以色、香、醇、浓、酸五大特征著称于世，富含氨基酸、糖类、有机酸、维生素等功效成分，具有软化血管、降低胆固醇、降低甘油三酯、抗菌、美容养颜等功效。山西老陈醋在陈酿过程中产生的沉淀物，受到消费者和企业的普遍关注，而关注的重点是老陈醋沉淀物带来的问题，严重影响着老陈醋的外观和食用。业界较少关注老陈醋沉淀物的功能成分及开发和利用价值。川芎嗪（四甲基吡嗪）是山西老陈醋的特征指标，本文通过对山西老陈醋沉淀物中川芎嗪（四甲基吡嗪）检测方法进行研究，为其开发和利用提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 试剂和材料

样品为某品牌1 年期、2 年期、3 年期山西老陈醋沉淀物。

盐酸川芎嗪标准品，中国食品药品检定研究院（其中含C8H12N2·HCl 以83.5℅计）；甲醇，色谱纯；磷酸二氢铵，优级纯；三氯甲烷、氢氧化钠、盐酸，均为分析纯。

微孔滤膜，孔径0.45μm；pH试纸。

盐酸川芎嗪标准储备液：精密称取30 mg 盐酸川芎嗪标准品，用重蒸水定容至25 mL，配制成1.002 0 mg/mL 的标准储备液。

1.2 仪器和设备

1260高效液相色谱仪，美国安捷伦仪器有限公司；TP-214 电子分析天平，美国丹佛仪器有限公司；AXTGL16M 高速离心机，山海赵迪生物科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备条件优化

采用单因素试验，分别考察样品pH 值、三氯甲烷提取次数、离心转速、离心时间对川芎嗪提取效果的影响，并在单因素试验的基础上进行正交试验，优选出样品制备的最佳条件。

1.3.1.1 pH单因素试验

准确称取待测样品2.00 g，将样品的pH 值分别调整为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，将调整后的样品置于分液漏斗中，加5.0 mL 氯仿，混匀萃取，以4 000 r/min 离心15 min，转移氯仿层；重复上述加入氯仿以后的操作3 次，合并氯仿层。以0.2 mol/L盐酸溶液分2次萃取氯仿相，每次4.50 mL，合并水相，用重蒸水定容至10.0 mL，经孔径0.45μm 滤膜过滤备用。

1.3.1.2 提取次数单因素试验

准确称取待测样品2.00 g，用氢氧化钠溶液调pH 值＞8.0，移入分液漏斗中加5.0 mL 氯仿，混匀萃取，以4 000 r/min 离心15 min，转移氯仿层；重复上述加入氯仿以后的操作，分别萃取2 次、3 次、4 次、5 次，合并氯仿层。以0.2 mol/L 盐酸溶液分2次萃取氯仿相，每次4.50 mL，合并水相，用重蒸水定容至10.0 mL，经孔径0.45μm滤膜过滤备用。

1.3.1.3 离心转速单因素试验

准确称取待测样品2.00 g，用氢氧化钠溶液调pH 值＞8.0，移入分液漏斗中加5.0 mL 氯仿，混匀萃取，分别以3 000 r/min、4 000 r/min、5 000 r/min、6 000 r/min、7 000 r/min、8 000 r/min 离心15 min，转移氯仿层；重复上述加入氯仿以后的操作3 次，合并氯仿层。以0.2 mol/L 盐酸溶液分2 次萃取氯仿相，每次4.50 mL，合并水相，用重蒸水定容至10.0 mL，经孔径0.45μm滤膜过滤备用。

1.3.1.4 离心时间单因素试验

准确称取待测样品2.00 g，用氢氧化钠溶液调pH 值＞8.0，移入分液漏斗加5.0 mL 氯仿，混匀萃取，以4 000 r/min 分别离心5 min、10 min、15 min、20 min，转移氯仿层；重复上述加入氯仿以后的操作3 次，合并氯仿层。以0.2 mol/L 盐酸溶液分2 次萃取氯仿相，每次4.50 mL，合并水相，用重蒸水定容至10.0 mL，经孔径0.45μm滤膜过滤备用。

1.3.2 标准曲线的绘制

精密吸取盐酸川芎嗪标准溶液0.05 mL、0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL，用重蒸水定容至10 mL（相当于每毫升含盐酸川芎嗪5.0μg、10.0μg、25.0μg、50.0μg、100.0μg）；分别进样10μL，于279 nm 处测量峰面积，每个稀释度重复进样3 次，取平均值，以质量浓度为横坐标，峰面积平均值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.3 仪器条件

色谱柱：C18柱，4.6 mm×150 mm×5μm；流动相：0.2 mmol/L 磷酸二氢铵∶甲醇=6∶4；流速∶0.8 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：10μL；检测波长：279 nm。

1.3.4 川芎嗪含量计算公式

式中：X—样品中川芎嗪的含量，mg/mL；

c—曲线得到样品中川芎嗪的质量浓度，μg/mL；

m—样品质量，g；

V2—试样定容体积，mL。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

按上述1.3.2 绘制标准曲线（图略），不同质量浓度的标准溶液对应的峰面积测定结果见下页表1。

由表1 结果表明，在质量浓度为5.0μg/mL～100.0μg/mL 的范围内，呈良好的线性关系，线性方程为：y=33.835 7x+8.290 34，相关系数为0.999 7。

表1 系列标准溶液测定结果

2.2 单因素试验结果

2.2.1 pH值对川芎嗪提取的影响

pH 值对川芎嗪提取的影响结果见下页图1。由图1可以看出，当pH值增大时，川芎嗪含量也随之增大。但是调节pH 值＞8 时，川芎嗪含量趋于平稳。因此，选择pH 值＞8。由曲线变化趋势可知，样品pH值对川芎嗪提取效果的影响较大。

2.2.2 提取次数对川芎嗪提取的影响

三氯甲烷提取次数对川芎嗪提取效果的影响结果见图2。从图2 可以看出，提取次数从1 次到2 次时，川芎嗪含量变化显著，说明单次提取不充分，但是2 次提取之后，提取含量增加不明显且较为平稳，为节约成本，选择提取次数2次较合适。

2.2.3 离心转速对川芎嗪提取的影响

离心转速对川芎嗪提取效果的影响结果见图3。从图3 可以看出，当离心转速提高时，有利于提取液的分离，可提高川芎嗪提取的有效性，但是离心转速超过4 000 r/min 时，提取含量趋于平稳，故离心转速选择4 000 r/min较合适。

2.2.4 离心时间对川芎嗪提取的影响

离心时间对川芎嗪提取效果的影响见图4。从图4 可以看出，当离心时间增加时，有利于川芎嗪的充分提取，但是离心15 min 以后，川芎嗪含量趋于稳定。因此，离心时间选择15 min较合适。

2.3 正交试验结果

根据单因素试验，设计正交试验，正交试验因素水平设计见表2，试验结果见下页表3，方差分析见表4。

表2 正交试验因素水平设计

表3 正交试验结果

表4 方差分析表

3 结论

根据直观分析表和方差分析表，得出影响川芎嗪提取的主要因素由大到小是：pH 值＞提取次数＞离心时间＞离心转速，且pH 值影响因素显著。山西老陈醋沉淀物川芎嗪测定的最佳条件为A3B2C1D3，即pH 值＞8，提取次数2 次，离心时间15 min，离心转速4 000 r/min。