外泌体与血管生成之间的关系及针灸干预机制

师 帅,张 倩,郑 义,张金朋,王亚楠△

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

血管因素疾病对人类的身体健康构成了严重的威胁。根据世界卫生组织的统计，每年大约有1 750万的患者死于血管因素疾病,占全球死亡比例的31%[1]。血管作为人类的重要器官,在输送氧气和营养物质到身体的各个部位的同时也可以诱发许多疾病。血管条件的不足通常会引发缺血性疾病,如心肌梗死与中风等。血管疾病的治疗预后与血管新生关系密切，外泌体(Exosomes)就是近年来发现的具有靶向性的促进血管新生的重要因子，研究其与血管因素造成的疾病之间的关系具有重要的意义，本研究对外泌体在血管因素相关疾病的机制中所起的重要作用做简要总结。近年来，外泌体以其拥有完整膜结构的生物囊泡，在人体细胞和脏器之间的信息传导中扮演着关键的角色，主导了人体许多生理现象与疾病的生理过程，并成为了血管疾病、神经疾病与癌症等领域的重要科研热点[2-3]。截止目前，外泌体中已经发现了9 769种蛋白质、3 408种mRNA、2 838种miRNA和1 116种的脂类物质[4]。目前针灸对外泌体的影响逐渐成为热点，多为学者从炎症、卒中等方面研究外泌体。

1 外泌体概述

1.1 外泌体的形态结构

外泌体是由活细胞分泌的直径为30～150 nm的小囊泡，当其与细胞质膜结合并产生融合体时，就会自发的分泌到细胞外，因此，基本上任何类型的细胞都能产生外泌体，其在人的体液中分布广泛，其内存着的细胞内来源脂质和RNA等生物活性物质[5]。

外泌体在细胞间的通讯中起着关键性的作用,可以影响细胞的很多功能,包括细胞的产生、增殖、凋亡与代谢等。目前认为,外泌体主要通过以下3种方式与受体细胞相结合:第一，外泌体将膜蛋白或其内容物传递给受体细胞,然后被受体细胞膜完全吞噬；第二，外泌体膜与受体细胞膜直接融合；第三，外泌体上的跨膜蛋白直接作用于受体细胞膜表面的信号分子。外泌体如何与受体细胞结合完全取决于外泌体的大小以及外泌体所携带的物质[6-7]。

1.2 外泌体来源及生物学特性

当外泌体于1980年被首次发现报道后，被认为是细胞排出垃圾的一个方法，现如今随着大量学者对其生物学起源、物质组成、运输与细胞之间信息的传递及在体液中分布的深入研究，发现了外泌体的功用是多种多样的。外泌体的体积大约为干细胞体积的百万分之一，其复杂性也更低，而且分子结构也更稳定，不容易被溶解，更便于制造和保存[8]。外泌体作为各种信号的传导体，与受体细胞相融合并放出其内含物质，介导细胞内部的信息传导与信息调控[9]。

近年的研究发现各种血小板、内皮细胞与干细胞等衍生的外泌体在促进血管新生和修复的受损心脏等方面发挥重要作用[10]。外泌体的功能主要包括在免疫中抗原呈递、受损组织的修补、神经系统的维持保护、促进髓鞘的再生以及血管再生等方面[11]。

1.3 外泌体来源的miRNA及其生物学特征

微小核苷酸(microRNAs,miRNAs)是一类全长约是18～25个核苷酸的非编码RNA，可以和靶基因3′非翻译区(3′UTR)相结合，并促进了靶基因mRNA的分解并控制了其翻译，从而在转录后水平负调节基因的功能表达[12]。有报道称，从血清和唾液中监测到的大部分miRNA均集中在外泌体中，而每个外泌体中都仅存在一种特定的miRNA[13]。外泌体miRNAs可以稳定地存在于患者的血液、尿液及其他人的体液中，而外泌体能够通过特殊的细胞表面蛋白质的产生、存在来表达其组织以及细胞中的物质来源[14]。

Valadi等在2007年首次证实外泌体内存在许多起重要作用的RNA分子，包括miRNA及mRNA和其他非编码RNA[15]。miRNA是非编码的内源性的小RNA分子，在调节基因表达中起着关键作用，由于其具有调节多个靶向基因的能力和其小尺寸，因此在提高脑卒中治疗的血管生成能力方面具有很大的潜力。外泌体细胞间的转运内含物到靶脏器中，利用其所携带的生物活性物质具有相同的作用，甚至更佳的医疗功效[16]。

展珊珊等发现miRNAs不仅可以作为血管疾病的诊断和预后的生物标志物，同时也具有显著的促进血管生成、调控细胞凋亡、抗炎及抑制纤维化等作用，外泌体来源的miRNAs在血管疾病的治疗方面有良好的应用前景[17]。

2 外泌体促进心血管生成

心血管疾病是一种常见病、多发病，其致残率和病死率都非常高。心血管疾病严重危害了人体健康，因为外泌体是由细胞起源的内涵体结构，主要携带的内容物也会因细胞的生理状态改变而发生数量和种类的变化[18]。因此，心血管疾病发生发展中所产生的外泌体内容物的成分可以作为疾病进行判断的标志物[19]。

有研究证明MSCs在SDF1来源的外泌体中过表达抑制缺血心肌细胞的自噬，促进内皮细胞微血管的生成，即SDF1过表达的MSCs释放的外泌体对缺血性心肌梗死起到重要作用[20]。Matsumoto等[21]收集了21例患者的血清，利用microarray技术证实外泌体在心力衰竭过程中发挥了多种的调节功能。更进一步数据分析表明，miR-92、miR-34及miR-194在病人的血清外泌体中显著增加，且与病发时的左心室的舒张状态关系密切。CPC衍生的外泌体中的5个miRNA(miR-378、miR-515、miR-384、miR-1224与miR-525)能够通过促进血管新生来改善心肌梗死后的心脏功能[22]；Gao等发现心肌梗死后缺血性心肌和肾脏释放的血清外泌体也能够通过传导miR-1956而激活旁分泌VEGF信号，从而达成了促进血管新生的目的[23]。Li等[24]研究发现，心肌缺血患者冠状动脉内的血清外泌体可以通过miRNA-939-iNOS-NO信号通道刺激内皮细胞的增殖代谢和血管生成。研究结果表明，在心肌祖细胞所形成的外泌体中，含有大量的miRNA-132和miRNA-210，可减少细胞的凋亡，miRNA-132还能促使内皮血管的再生，在心肌梗死损伤中发挥了保护性作用[25]。Kuwabara等[12]通过研究比较了急性冠脉综合征病人和正常人的血清中miRNA-133a和miRNA-1的水平，表明了急性冠脉综合征病人血清中的miRNA-1和miRNA-133a比一般正常人显著增多，miRNA-133a也可能经由外泌体进入血液循环。

血管平滑肌细胞所产生的外泌体miR-155，由平滑肌细胞传递至血管内皮细胞，从而损坏了内皮屏障的完整性，并引起内皮渗透性的提高，从而加快了动脉粥样硬化的发展速度，这可能与Krüppel-5有关，阻断了外泌体介导的miR-155在血管内皮细胞和平滑肌细胞之间的相互传递，可能是防治动脉粥样硬化的新靶点[26]。

3 外泌体miRNA促进卒中后的血管生成

外泌体也可通过血脑屏障(Blood brain barrier,BBB)在缺血性脑卒中时由脑神经元合成和释放，并可以在外周血中检测到。此外，中风后血细胞和内皮细胞也会发生反应并将外泌体释放到血液中。因此，外泌体可能是表现缺血性脑卒中疾病发展和促进其康复过程的生物标志物[17]。目前，外泌体对脑梗死的预防和治疗方面仅限于临床研究。首先，外泌体可以通过干细胞表达相关基因或运输相关调控蛋白；其次，外泌体可以作为药物传递载体，通过脂质体转染或电穿孔等方法直接地将治疗药物转运到外泌体中，从而达到治疗的目的[1]。随着对外泌体研究的深入，已证实了外泌体在调节细胞之间信息交互的同时，也更加广泛地参与了脑血管系统的病理、生理过程，并在缺血性脑卒中的血管新生机制中发挥重要作用[27]。由于外泌体独特的结构和生理功能，使外泌体能够自由地通过血脑屏障，稳定地存在于血液中，结合血液标本易于获取的优点，外泌体具有多种不同的、潜在的应用前景[28]。经研究表明，miRNAs除在外泌体防治缺血性脑卒中时起到了很大的功效，并对于卒中的诊断和预后评估中发挥着关键的作用[29]。

血管新生指的是由现有的大脑血管内皮细胞(Vascular endothelial cell，VEC)在小毛细血管床的生长和迁移，进而形成新生的血管，向身体不同脏器和组织供应氧气和营养，这不但是一种正常的生理过程，也是对神经系统疾病的一种自然防御反应。重建的功能性脑微血管网络可以改善局部血液供应，从而促进缺血性脑卒中的修复。血管新生的程度往往与减少脑梗死和神经功能的恢复改善关系密切，因此，促进缺血后的血管新生是临床上对于缺血性脑卒中的治疗的重要治疗策略[16]。血管的新生需要大量的生长因子，如成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor，FGF)和血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)。而外泌体可以将所包含的miRNAs传递到脑内皮细胞中，进而促使内皮细胞的迁移、生长和血管生成。Yin等研究表明，在急性脑缺血的小鼠模型中，通过下调脑血管中miR-15a的水平可以使FGF2和VEGF的表达水平上调，促进脑卒中外周区的血管新生[30]。经过一系列的科学研究后证实，外泌体源性mRNA和miRNA网络在介导大脑修复的过程中都起到了重要的影响作用[31]。

MiR-210是原发性缺氧诱导的主miRNA(缺氧-miR)，通过血管内皮生长因子(VEGF)信号通路来促进血管新生[32]。ZHANG等研究发现[33]，miR-210被认为是一个潜在的治疗靶点。临床研究也证实，预后较好的缺血性脑卒中患者miR-210的水平显著超过了预后较差的脑卒中患者。当血管内皮细胞遭受应激后，会释放带有血管内皮生长因子B(VEGF-B)mRNA的外泌体，然后外泌体被损伤的血管内皮细胞所内吞，从而增加了损伤的血管内皮细胞中VEGF的表达，从而达到修补损伤的内皮细胞的目的，并促使血管修复[34]。昝兴淳等发现除了大脑的内皮细胞外，循环内皮祖细胞也参加了血管的生成。由循环内皮祖细胞所分泌的外泌体可以将与促进血管生成有关的miR-296和miR-126转移到受体内皮细胞中，并促进血管新生[35]。梁云云等[36]在实验中发现，患有缺血性脑卒中的患者血小板外泌体所携带的miR-126表达明显超过了健康对照组，表明血小板外泌体及其所携带的miR-126可能对缺血性脑卒中病人的血管生成起到了关键性的作用。有学者研究了急性脑梗死患者的血清中外泌体的miR-9、miR-124水平的变化，与对照组比较，miR-9、miR-124表达水平显著升高，且与NIHSS评分、临床神经功能缺损量表血清白细胞介素-6浓度呈线性正相关[37]。这两种外泌体可能是诊断缺血性脑卒中和评估神经损伤程度的生物标志物。Van等研究发现外泌体miRNA-214诱导受体细胞的迁移和血管新生，而血管内皮细胞外泌体沉默的mirNA-214则没有诱导受体细胞迁移和血管生成[38]。有研究结果显示[39]，MSC-外泌体可以将miR-133b转移至神经细胞促进缺血性脑卒中后神经功能的恢复。诱导脑血管新生是改善缺血性脑卒中损伤后恢复功能的关键。张晓星等[40]的研究表明，人脐静脉内皮细胞来源的外泌体(HUVECs-exo)可以减小缺血性脑卒中后的梗死面积，促进梗死边缘血管和神经元的再生，并促使突触的重塑，因而提高了缺血性卒中后的神经预后。

张晶晶等研究表明[41]，脑缺血受损后能够活化血管内的Wnt信号通路，经典的Wnt/β-catenin信号转导通路可促进血管内皮细胞的血管生成,可以增强血管内皮生长因子(VEGF)和促血管生成素2(Ang2)的表达[42-43]。血管再生开始于脑缺血和缺氧后24 h内，脑组织产生了大量内源性Wnt/β-catenin信号通路、VEGF，可能是治疗缺血性脑卒中和促进血管生成的潜在靶点[35]外泌体表面携带Wnt，以诱导靶细胞中Wnt信号活性。纯化的外泌体可以诱导Wnt信号传导活性,与受体Evi/wi一起，Wnts通过内体间质转运到外泌体上。有研究证明了Wnt蛋白的细胞外囊泡转运在进化上保守的功能作用[44]。有研究表明[42]，刺激血管新生是治疗缺血性脑卒中的有效方法。其机制可能是通过调节经典Wnt/β-catenin信号，靶向性地上调与血管新生的相关因子表达。因此，可以推测外泌体可以调节经典Wnt/β-catenin信号通路，促进缺血性脑卒中后的血管新生。

众多证据表明，外泌体可修复脑血管损伤、促进血管新生从而延缓病理进程及病发预后等，具有很大的临床应用潜力。

4 针灸与外泌体的关系

整体观是中医学的核心理论，针灸的治疗作用也具有整体性的特点，动物实验和临床应用研究证实，针灸能够调整呼吸系统、消化系统、泌尿系统、内分泌系统、神经系统和免疫系统的异常功能，针灸对某一个脏器的调整作用是可以通过对该脏器的所属系统乃至全身系统的功能在多个层次及水平上进行的总体调节而实现的，从穴位至全身，由点及面，通过针灸刺激体表腧穴从而达到调节机体整体状态的作用。目前对针灸的效应机制的研究主要是以通过代谢组学、蛋白组学等技术为主[35]，观察并检测特异性的指标，推导针灸的机理。根据上述的研究方法，探索外泌体在针刺效应机制中起到的作用，为进一步阐明针灸的作用机制提供了新的研究方向。外泌体对针灸刺激的应答主要通过3个方面：第一，外泌体能够广泛地接收信号并对其作出反应；其次，外泌体可以充当传递针刺信号的信使；第三，由自稳态系统分泌的外泌体能刺激针灸的双向调节机制，维持体内的平衡。

4.1 针灸通过调控外泌体影响炎症因子

针灸调控炎症反应的机制之一是通过降低血清中外泌体的表达。王士源等通过研究发现[45]，将血清外泌体中的miRNAs作为观察指标，研究了隔药饼灸双侧的气海穴、天枢穴对于克罗恩病的治疗机制。根据试验结果，推测隔药饼灸的作用机制可能是通过降低克罗恩大鼠血清外泌体中的miR-30b-5p的表达来改善克罗恩病症状。针灸不仅可以下调外泌体的表达水平，还可以通过上调其表达水平来调节炎症的反应。叶静[46]通过检测血清外泌体中的microRNA的释放趋势，探索其在临床针刺治疗膝骨性关节炎的过程中起到的作用。结果表明，针刺治疗可能是通过降低血清外泌体中的miR-3168、miR-1296-5p、miR-1228-5p的表达以及通过调控细胞的凋亡自噬、凋亡代谢和MAPK信号通路等方式在膝骨性关节炎的治疗中发挥作用。

4.2 针灸通过调控外泌体刺激血管新生

Klein等[47]认为，低频电刺激联合针灸通过刺激血清外泌体中miR-181水平的升高，而后外泌体的介导使肾血流量增加，慢性肾病肌肉蛋白合成代谢增加，从而达到预防、治疗肌肉萎缩的目的。李巧凤等[16]认为针刺能够保护缺血性脑卒中患者的脑神经元，改善血液供应的机制，针刺可以提高外泌体的表达水平，刺激瞬时受体电位的离子通道蛋白，促进血管新生和氧糖剥夺后的脑微血管内皮细胞的迁移。金婷婷等[48]经研究发现电针足三里穴、曲池穴可以通过增加小胶质细胞衍生的外泌体的分泌，可以有效改善缺血再灌注大鼠运动功能，缓解缺血再灌注损伤后神经功能的缺损。

ZHOU等[49]用电针刺激大脑中动脉缺血(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型大鼠，发现电针能够抑制miR-191a-5p的表达，减少细胞凋亡，从而保护脑组织。季一峰等[50]研究发现，在针刺的作用下，间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC)的水平提高。MSC水平提高则会产生更多的间充质干细胞外泌体(Mesenchymal stem cell exosomes,MSC-Exo)作用于靶细胞，使得miRNAs的表达增加，从而抑制细胞的凋亡，形成脑保护作用。根据李牧洋等[51]的实验，对正常大鼠持续电针发现:针刺1 d后,血清中外泌体水平显著升高。针刺5 d后,外泌体继续升高，说明了针刺对外泌体的刺激作用，而外泌体在血管再生的机制中起着至关重要的作用，由此可以推测针刺可以促进外泌体水平从而达到治疗血管因素疾病的目的。

5 小结

除了心血管和脑血管疾病的治疗，大量研究发现外泌体及其miRNA在肿瘤、肝、肾、视网膜、牙髓及骨等疾病的血管再生治疗方面上均呈现出作为新型分子标志物的巨大潜力[52-55]。

血管疾病严重威胁着人类的健康和生活质量，探寻其发病的机制、保护策略及防治预后是血管因素疾病研究工作领域的关键问题。诸多证据证实，外泌体在修复血管及和促进血管生成方面起了重要作用。外泌体在血管因素疾病的病理生理机制起到了关键性作用，随着外泌体外源性miRNA在血管疾病治疗中的不断深入，其所产生的治疗价值也更显著，受到社会各界的关注。目前，针刺治疗血管因素疾病的机制主要为通过扩张血管、改善血液的流变性，增加侧支血液循环，改善脑部的血液供应，降低血液黏稠度等，针刺对于外泌体的作用与特定穴位之间的关联也有待考究，针灸广泛应用在血管因素疾病尤其是脑血管疾病的治疗中，其可以调节外泌体的活性物质，但具体机制尚不清楚。现在大多数外泌体与针刺之间的研究还大多在针灸与炎症的关系，而未来的方向可以延伸到针刺对外泌体与血管再生之间的联系，进一步开展有关实验，有助于研究针刺对外泌体的影响，以确保其早日安全应用。