荧光定量PCR 检测法在阴道加德纳菌检测中的 应用价值

林爽

细菌性阴道炎作为一种育龄女性常见疾病,与女性阴道内的加德纳菌群情况存在密切关系［1］。研究显示,在细菌性阴道炎患者的阴道内微生物菌群中加德纳菌处于显著优势地位,且高于其他正常菌群［2］,因此,阴道内加德纳菌群的科学检测对于提高临床治疗效果具有重要现实意义。当前,临床对于阴道内加德纳菌的检查主要通过涂片革兰染色发现线索细胞、免疫荧光检测、细菌分离培养以及PCR 检测等［3］。基于此,本次研究分别对比细菌性阴道炎女性和健康女性行荧光定量PCR 检测加德纳菌的临床效果,分析PCR 检测阴道内加德纳菌的诊断价值,详情如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择本院2019 年1 月～2020 年12 月收治的30 例细菌性阴道炎患者作为实验组,另选择30 例同期健康体检的健康女性作为对照组。实验组年龄18～45 岁,平均年龄(33.84±5.49)岁。对照组年龄18～45 岁,平均年龄(33.92±5.45)岁。两组年龄等一般资料比较差异无统计学意义(P＞0.05),具有可比性。

1.2 纳入及排除标准

1.2.1 纳入标准 实验组符合细菌性阴道炎诊断标准；对照组不存在任何阴道炎病变；两组患者均知晓本次实验,且自愿参与,经医院伦理委员会同意。

1.2.2 排除标准 研究对象存在传染病变；凝血功能障碍；哺乳或孕期。

1.3 方法 两组研究对象均接受荧光定量PCR 检测法检测,采用无菌棉拭子在女性阴道壁下1/3 处部位采集分泌物,并将其放于无菌试管内送检。棉拭子需在PBS 缓冲液汇总进行震荡悬浮后对其进行离心处理,随后收集沉淀菌体。根据提及试剂盒说明书提取细菌DNA,并放于-70℃环境中保存。加德纳菌的引物合成参考文献［3］。

定性PCR 反应体系下,保证上下游引物分别各为0.5 μl,模板设置为3 μl,使用双蒸水补足25 μl。PCR 循环参数需设置为94℃环境下预变形5 min,94℃下进行45 s,55℃下进行45 s。将加德纳菌标准菌株放置于LB培养基内进行常规培养,并选择单个培养菌落,提取细菌基因组的DNA 对其进行常规的PCR 扩增处理,并使用2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。阳性产物切胶纯化之后回收,并对其进行连接反应,实际操作步骤根据试剂盒说明书进行详细操作。调节基线至合适的位置,保证各个荧光曲线与基线的交叉点作为主要的数值,并根据标准曲线上的浓度以及数值对应关系获取各个待检测标本的初始浓度。针对不同浓度的DNA 模板进行连续荧光定量PCR 反应,根据浓度做平行管,合理计算变异系数。

1.4 观察指标 对比两组定性PCR 检测结果以及阳性率。

1.5 统计学方法 采用SPSS23.0 统计学软件处理数据。计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 定性PCR 检测结果 实验组标本进行实时定性PCR 检测后PCR 扩增产物经过电泳检测后可以发现111 bp 特异性条带。对其进行序列分析,实验结果与同源性对比发现,扩增DNA 片段与序列符合率100%。

2.2 阳性率 依据Amsel 诊断标准,实验组30 份样本中加德纳菌阳性标本数为28 份,阳性率为93.33%；对照组30 份样本中加德纳菌阳性标本数为12 份,阳性率为40.00%。实验组加德纳菌阳性率高于对照组,差异有统计学意义(χ2=19.2000,P=0.000＜0.05)。

3 讨论

阴道炎中不同的病原菌可导致不同类型的阴道炎,如滴虫性阴道炎、细菌性阴道炎和霉菌性阴道炎［4］。滴虫性阴道炎患者会出现阴道不适、疼痛瘙痒的症状,呈黄绿色稀薄的泡沫样白带。细菌性阴道炎是由阴道内加德纳菌导致的一种阴道炎症。细菌性阴道炎作为妇科常见的疾病,其主要以女性阴道内菌群比例失衡作为主要病变的传染性病变［5］。细菌性阴道炎病因尚不明确,但部分学者认为是由于加德纳菌与厌氧菌混合感染所致,其是该病的主要发生因素［6］。现阶段,临床微生物检查中常规的分离检查方法是基础诊断措施,应用范围比较广泛。传统的细菌实验室检查以及鉴别,主要是根据细胞的组织形态性特征以及生理性状,对细菌进行培养以及生化反应、免疫学检测等［7］,检测环节十分复杂,且无法给出理想的鉴定结果。随着我国分子生物学的发展,PCR 技术以快速、敏感以及特异的优势,灵活用于微生物检测中。

细菌性阴道炎、其他类型阴道炎以及健康女性阴道分泌物都能检出加德纳菌。研究显示,细菌性阴道炎患者和健康女性检查中的加德纳菌检出率存在显著差异［8］。因此,不能单纯对细菌性阴道炎女性进行PCR 检测,还需对其进行定量研究,以此明确检测结果,为临床医生提供更多的诊断数据。荧光定量PCR检测法是一种可以进行定量检测的基因扩增的PCR 技术,此种检测技术的住院原理是在PCR 系统中添加一些荧光染料或者荧光分子标记的寡核苷酸链,通过物质和PCR 相结合产生特定的物质,且此种物质在紫外线的刺激之下,可以发生特定的荧光。检测人员通过观察实验检测的荧光信号可以将检测体系中相关数值显示出来,促使检测人员可以将检测的基因数量拷贝出来,并根据其推理最初的基因数量。荧光标记的探针汇总主要包括水解探针和杂交探针［9］。而荧光定量PCR 检测法中主要包括［10-12］：①绝对的定量措施,通过构建合理的基因序列标准,并对其进行一系列的定量检测工作,将标准品进行合理的稀释工作之后可以获得多个不同稀释之后的循环阈值(Ct 值)数值。而Ct 数值也是被检测标本荧光达到荧光阈值的循环数量,其主要是将核算数量作为根本的横坐标,将log(Ct)作为纵坐标进行绘制的标准曲线,其通过检测标本的Ct 值在坐标上的位置可以基本判定检测标本的核算数量；②相对定量：其主要是检测人员根据公式进行推到获得的基因,可以直接对目的基因相对管家基因的量,检测人员不需要做一些额外的标准曲线,其具有简便、省时等优势。

荧光定量PCR 检测法还具有以下几种检测优势：检测人员可以实时检测检测标本的基因扩增数量,并定量估算样本中存在的基因初始数量,并经过检测中的荧光信号清晰获取PCR 的全过程［13］。检测人员进行的操作比较简单,且需要消耗的检测时间比较短,其具有较高的特异性以及灵敏度,可以显著提升检测的准确性［14］。检测人员在封闭的环境中进行荧光定量PCR 实时检测工作,可以显著降低标本发生污染的几率［15］。现如今,荧光定量PCR 已经获得积极普及使用,而对于mRNA 基因的表达研究、多个不同基因的定量分析、点突变的分析以及等位基因分析、单核苷酸多态性分析以及多个微生物,都可以进行定量、定性的检测分析工作［16］。

本次研究显示,实验组标本进行实时定性PCR 检测,PCR 扩增产物经过电泳检测后可以发现111 bp 特异性条带。对其进行序列分析,实验结果与同源性对比发现,扩增DNA 片段与序列符合率100%。实验组加德纳菌阳性率高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05)。由此可见,对细菌性阴道炎患者进行实时荧光定量PCR 检测法检测,可以灵活检测出阴道内的加德纳菌含量,进而为医生的诊断提供依据。本次实验通过建立实时荧光定量PCR 检测细菌性阴道炎女性体内的加德纳菌含量,其具有灵敏度、可重复操作的优势,可以准确发现患者体内的加德纳菌DNA 含量,帮助医生对患者进行更好的诊断。

综上所述,对细菌性阴道炎患者进行实施荧光定量PCR 法检测检测加德纳菌,可以帮助医生刚好诊断病情,提高诊治效果。