3 种标记方法对刀鲚幼鱼生长影响初探

张秋宏，蒋日进，刘明智，王 静，肖 祎，杨 凡，周永东，冯广朋

（1.浙江海洋大学海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，农业农村部重点渔场渔业资源科学观测试验站，浙江省海洋渔业资源可持续利用技术研究重点实验室，浙江舟山 316021；2.中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090）

刀鲚Coilia nasus属鲱形目Clupeiformes 鳀科Engraulidae 鲚属Coilia，是一种主要生活在我国长江流域的溯河洄游型鱼类。刀鲚味道鲜美，深受广大人民喜爱，同鲥鱼Tenualosa reevesi、暗纹东方鲀Takifugu obscurus有“长江三鲜”的美誉[1]。刀鲚历史的最大渔获量高达3 750 t，是长江下游流域及河口水域的重要经济鱼种[2]。但是随着经济的发展，长江口的水域污染加剧、生态环境的恶化以及在过度捕捞的影响下，使得渔业资源受到了严重的威胁，刀鲚也处于濒危保护状态[3]。增殖放流对于渔业资源恢复、保护鱼类种群、满足人们对于水产品的需求以及生态水域平衡都起到重要作用，因此开展刀鲚的人工增殖放流，就显得尤为关键[4]，与此对应的标记放流方法选择也具有了重要的意义。常用的鱼类标记方法分为体内标记法、体外标记法、分子遗传标记法、生物遥测法、化学标记法等[5]。本文研究的茜素络合物（alizarin complexone,ALC）和六水合氯化锶（hexahydrate strontium chloride）对于刀鲚耳石的标记方法属于化学标记法，剪鳍标记方法属于体外标记法[6]，合适的标记技术选择是标记放流成功的关键，重点关注死亡率和标记保留时间[7]。本文着重从死亡率方面对3 种标记方法进行初步探索，其目的是为了对比3 种标记方法的死亡率差异，为后续的刀鲚幼鱼增殖放流合适标记方法的选择提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用刀鲚鱼苗都为上海市水产研究所奉贤基地培育的40 日龄健康幼鱼，体长3～5 cm。

1.1.1 ALC 标记实验材料

ALC 标记实验开始前，在24 h 曝气的水泥池中暂养5 d。水池每日清洁，吸污。水池温度27.4～28.1 ℃，盐度为1.3～1.4，暂养用水呈弱碱性。暂养期间，分别于09:00 和16:00 1 d 2 次投喂人工培育的开口饵料，每日清理培育池1 次，鱼苗摄食正常，存活率良好。暂养结束后，鱼苗转入24 h 曝气的培养箱，在培养箱稳定6 h 后开始浸泡染色实验，染色期间不喂食。染色所用试剂为茜素络合物（ALC），分子式C14H7NaO7S·H2O，分析纯制剂，培养箱水温为27.6～28.2 ℃，盐度1.3～1.4，pH 为8.3～8.4 呈弱碱性。

1.1.2 锶元素标记实验材料

锶元素标记实验开始前，将幼鱼放入24 h 曝气培养箱中，暂养1 d，不投喂饵料，从第2 天起，每日吸污1 次，隔天换水50%，每次换水后，在标记组中加入一定量的SrCl2·6H20 调节Sr2+的浓度。分别于09:00和16:00 每天2 次投喂人工培育的开口饵料。培养箱水温为27.3～28.1℃，盐度1.3～1.4，pH 为8.3～8.4 呈弱碱性。实验采用的SrCl2·6H2O 为分析纯制剂，采购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 剪鳍标记实验材料

剪鳍标记实验开始前，幼鱼在24 h 曝气水泥池中暂养5 d，水池每日清洁吸污，其环境和ALC 标记实验环境相同。于09:00 和16:00 1 d 2 次投喂人工培育的开口饵料，暂养结束后在鱼苗转入前，将曝气培养箱和剪鳍工具用高锰酸钾稀释溶液浸泡消毒30 min，在培养箱中稳定6 h 后开始剪鳍实验，实验期间不投喂饵料。培养箱水温27.6～28.0 ℃，盐度1.3～1.4，pH 为8.3～8.4 呈弱碱性。剪鳍标志时，实验操作人员戴橡胶手套，随机选取鱼苗，左手轻握鱼体，右手持眼科剪，按实验分组将鱼体不同部位的鳍条沿鳍基部完全剪除，剪鳍失败或剪鳍后活力明显下降的鱼不用于后期实验。

1.2 实验方法

1.2.1 ALC 标记实验方法

ALC 标记实验所用40 L 培养箱，初始每组20 尾刀鲚鱼苗，浸泡过程中向水体中充气，首次实验共设置4 个ALC 标记浓度，分别为0、50、100、150、200 mg·L-1，每个浓度下设3 个平行组，共15 个培养箱，用消毒烧杯盛装已配制实验所需浓度浸泡液，实验开始时将各组刀鲚幼鱼分别放入相应浓度的培养箱中，持续浸泡时间为48 h，在实验中观察其行为和中毒后的状况，经外界多次刺激无反应认定为死亡，将死亡的刀鲚捞出，分别记录浸泡2、6、12、18、24、36 和48 h 的死亡数量，计算其累计死亡率。在实验中发现150、200 mg·L-1浓度浸泡的刀鲚幼鱼个体在短时间内全部死亡，100 mg·L-1浓度浸泡的死亡率也较高，但其死亡率有着明显的下降趋势。为了进一步研究低浓度浸泡的效果，第2 次实验在外界环境和方法同第1 次实验相同的情况下分别设置实验ALC 浓度为0、30、60 和90 mg·L-1，分别记录浸泡6、12、18、24 和48 h 的死亡率。

1.2.2 锶元素标记实验方法

锶元素标记实验采用300 L 培养箱，每箱放入150 尾刀鲚幼鱼，依据海水中的锶含量，分别设置浓度为0、12、24、48、60 mg·L-1的锶溶液进行浸泡试验，每组试验设置3 个平行组。标记持续时间为8 d，每天每4 h 观察1 次幼鱼活动情况，及时捞出死鱼，并统计死亡情况。标记结束后，将幼鱼转移至无锶经沉淀后的淡水水体中养殖，养殖环境和实验环境相同。

1.2.3 剪鳍标记实验方法

剪鳍标记实验采用40 L 培养箱，实验设置4 个组（未剪鳍对照组、剪尾鳍标志A 组、剪右胸鳍标志B组、剪右腹鳍标志C 组），对照组和实验每组设置4 个平行组，每组放入20 尾鱼。在剪鳍后的第1、2、4、6、8、24 h 观察并记录各组（包括对照组）鱼的死亡、游泳行为等情况。

1.3 数据处理

刀鲚幼鱼体长体质量可以表征其生长情况，其二者关系可以用幂函数拟合，对刀鲚幼鱼体长体质量数据分析，其公式为[8]：

式中：L为刀鲚幼鱼体长，mm；W表示刀鲚幼鱼体质量，g；a为生长条件因子；b为幂指数系数。

本研究标记后死亡率数据通过SPSS Statistics 23 软件处理，进行单因素方差分析（one-way ANOVA）和Duncan 多重比较。

2 结果与分析

2.1 标记存活和死亡率

在ALC 标记第1 次实验中，在100、150 和200 mg·L-1浸泡浓度下鱼苗在较短时间内死亡率较高，其中50 mg·L-1死亡率相对较低，在第2 次实验中，为了更精确探究茜素络合物标记死亡浓度，围绕着50 mg·L-1浓度做出0、30、60 和90 mg·L-1，分别记录浸泡6、12、18、24 和48 h 的死亡率并计算累计死亡率实验结果（图1）。结果表明对照组（0 mg·L-1）和其他标记组呈显著性差异（P＜0.05），30 和60 mg·L-1标记组无显著性差异（P＞0.05），60 和90 mg·L-1标记组无显著性差异（P＞0.05），其中不同小写字母表示差异性显著。

图1 第二次实验茜素红标记下刀鲚幼鱼累积死亡率Fig.1 Cumulative mortality rate of C.nasus juveniles under the alizarin complex marking of in the second experiment

在锶元素标记实验中，在不同浓度梯度下均发生死亡现象，但各个浓度下的刀鲚累计死亡率均处于较低水平，其中每天累计死亡率最高值对应的是Sr2+浓度为24 mg·L-1，且累计死亡率随着Sr2+浓度上升呈同向趋势（图2），通过对于不同浓度实验组累计死亡率同对照组进行显著性分析，得出结论是除24 mg·L-1浓度实验组与对照组有显著性差异（P＜0.05），其他均无显著性差异（P＞0.05），其中不同小写字母表示差异性显著。结果表明实验组锶浓度对刀鲚幼鱼死亡率影响很小。通过观察实验中标记组与实验组幼鱼摄食、游泳状态均无差异。

图2 刀鲚幼鱼不同锶浓度的累积死亡率Fig.2 Cumulative mortality rate of C.nasus juveniles in different strontium concentration

在剪鳍标记实验中，通过对于刀鲚幼鱼剪鳍标记死亡个体在死亡前运动方式的观察发现刀鲚被剪尾鳍放入暂养水箱后，平衡能力下降，尾部抖动频率加快，上下摆动；一段时间后，失衡状态继续，鱼苗开始头部向下、尾部向上，左右摆动，开始往角落游动，身体晃动频率加快持续一小段时间，经历躺平-游动-躺平等间歇，直至无力游动、死亡。刀鲚被剪右胸鳍放入暂养水箱后，平衡和活跃能力明显下降，大多在底层游动，鱼体偏向一侧游动；鱼体明显左右摆动，东倒西歪，在水体底层或上层间歇性游动，直至死亡。刀鲚被剪右腹鳍放入暂养水箱后，平衡能力尚好，未出现明显的失衡状态；一段时间后，鱼体活跃能力下降，但游泳行为较正常；在鱼体接近死亡前，出现游泳能力减弱，平衡能力下降等情况，直至死亡。

在剪鳍标记实验中，通过单因素方差分析，其存活情况分析结果表明了除剪鳍后2 h 各组间存活率存在显著性差异（P＜0.05）以外，其余时段各组间存活率差异不显著（P＞0.05）（表1）实验对照组在前2 h 存活率为100%，于第4 h 存活率下降为99%，24 h 的最终存活率为99%。刀鲚幼鱼24 h 最终实验结果存活率由大到小表现为：对照组（99%）＞剪尾鳍（25.85%）＞剪右侧腹鳍（15%）＞剪右侧胸鳍（8.33%）。

表1 实验各组剪鳍后的存活率（%）Tab.1 Survival of each group after cut-fin（%）

2.2 体长-体质量关系

为了探究锶元素标记是否影响刀鲚幼鱼的生长，在各浓度的实验组各取10 尾标记8 d 后的刀鲚幼鱼，同对照组幼鱼进行体长、体质量的测量。其中实验组的平均体长、体质量分别是39.23±4.33 mm、0.36±0.07 g，对照组平均体长、体质量分别是39.70±5.08 mm、0.26±0.08 g（表2）。采用幂函数拟合刀鲚幼鱼体长-体质量关系，结果如下：

表2 刀鲚标记组与对照组体长-体质量关系参数值Tab.2 Parameter values of length-weight relationship in marked C.nasus juveniles and the controls

实验组和对照组幂指数均不等于3，属于异速生长，且相差很小（图3）。通过进一步探究锶元素标记对刀鲚幼鱼体长和体质量影响，利用单因素方差分析，对各浓度体长和体质量与对照组进行差异性检验。结果表明，各实验组刀鲚幼鱼体长-体质量关系与对照组均呈现不显著差异（P＞0.05），说明该标记对刀鲚幼鱼生长影响不大，各浓度下的锶元素标记对于刀鲚幼鱼的生长干扰较小。

图3 刀鲚幼鱼体长-体重关系Fig.3 Relationship of body length-weight in C.nasus juveniles

3 讨论

3.1 茜素络合物标记对刀鲚幼鱼死亡率的影响

荧光标志物会在鱼类耳石、硬骨组织以及鱼类的鳞片中形成永久的标记，现如今已有多种荧光物质被研究应用到鱼类标记中[9-11]。研究表明茜素络合物有着较好的标记效果，但不同鱼种对于茜素络合物敏感程度不同，且茜素络合物浸泡浓度和鱼类致死率呈正相关。欧阳斌等[11]利用茜素络合物对稀有鮈鲫Gobiocypris rarus和彭泽鲫Carassius auratusvar.Pengze 仔稚鱼标记，当浸泡浓度为30～100 mg·L-1（浸泡24 h）死亡率为0，在浓度为200 mg·L-1时，二者均出现100%死亡率；王正鲲等[12]发现唐鱼Tanichthys albonubes幼鱼在80和100 mg·L-1的茜素络合物中浸泡24 h，死亡率均为0，而在150 和200 mg·L-1的浸泡浓度下死亡率分别达到44%和100%。付自东等[13]用茜素络合物对胭脂鱼Myxocyprinus asiaticus仔鱼进行浸泡实验中发现在浓度为50～200 mg·L-1的茜素络合物（24 h）的死亡率为0，当浓度到达250 mg·L-1时死亡率达到90%。赵亚鹏等[14]用茜素络合物对滇池金线鲃Sinocyclocheilus grahami进行标记浸泡实验中发现当浓度为50～100 mg·L-1的茜素络合物（浸泡4～8 h）滇池金线鲃仔鱼死亡率为0；当浓度达到150 mg·L-1时（浸泡8 h）仔鱼死亡率为30%；当浓度大于200 mg·L-1时90 d 滇池金线鲃稚鱼全部死亡。本次实验结果显示，在第1 次实验中较高浸泡浓度（100～200 mg·L-1）的茜素络合物对于刀鲚幼鱼有较高的致死率，当浓度达到200 mg·L-1刀鲚幼鱼在6 h 内全部死亡。在第2 次实验中设置较低浓度梯度下的30、60、90 mg·L-1标记组，随着浓度上升死亡率也呈现显著的上升趋势，这也同样论证了上述观点。就死亡率而言，浓度为30 mg·L-1的茜素络合物是刀鲚幼鱼相对适宜的浸泡浓度，但仍然有较高的死亡率。

3.2 锶元素标记对刀鲚幼鱼生长影响

锶元素广泛存在于自然水域中，锶元素含量与分布方式在不同水域中通常存在显著差异（淡水区含量低、河口区中、海水区高）[15]。锶元素标记技术，所采用的浸泡的方式，具有便于操作、标记信息持续时间长久、标记苗种规格限制小等特点[16]。通过实验分析不同锶浓度对刀鲚幼鱼影响：Sr2+浓度为24 mg·L-1时，死亡率最高，分析其原因可能是吸污时人为操作不当，造成幼鱼损伤导致死亡。除24 mg·L-1浓度外，在0～60 mg·L-1范围内，锶元素标记对刀鲚生长与死亡均无显著性影响。相关研究发现锶的浓度与孵化率有显著的相关性，但与幼鱼的死亡率没有关联[17-18]。通过对刀鲚幼鱼体长体质量数据分析，发现锶元素标记对刀鲚幼鱼生长影响较小。

3.3 剪鳍标记对刀鲚幼鱼死亡率的影响

鱼鳍有强大的再生能力，剪鳍标记具有简易便行、易操作、成本低等优点，但是剪鳍标记仍旧会有损伤鱼体，而且保存率较低的缺点[19]。刀鲚幼鱼有着较快的生长速度，平均每天生长1 mm 左右[20]，因此在标记中应尽量保持剪鳍后剩余鳍长一致，避免由于鳍长所导致的生长差距，同时剪一侧胸鳍会导致鱼类在水中游动时会无法掌握平衡，对鱼的生长存活有着较大的影响[21]。本次实验结果显示，剪鳍后2 h 各组间存活率存在显著性差异（P＜0.05）；其余时段则差异不显著（P＞0.05），各组存活率为对照组（99%）＞剪尾鳍（25.85%）＞剪右侧腹鳍（15%）＞剪右侧胸鳍（8.33%）。就存活率而言，体外标记中剪尾鳍是相对适宜的方法，但张春光等[22]研究显示刀鲚由于外部原因造成的断尾再生尾鳍异常现象大量存在，这对刀鲚幼鱼剪尾鳍标记效果会产生一定影响。

4 结论

ALC 标记实验有着较高的死亡率，该实验的不足之处是没有对耳石标记效果进行检验，无法判断在30 mg·L-1浸泡浓度下的标记效果，后续将进行补充实验来探究该浓度下的标记效果，从而判断是否进行更低浓度的补充实验。剪鳍标记作为体外标记对于刀鲚幼鱼有较大的损伤，造成了较高的死亡率，该标记方法对于刀鲚幼鱼而言不适用，锶元素标记为刀鲚幼鱼最适合的标记方法，该方法相较于茜素络合物和剪鳍标记有较低的死亡率，且对刀鲚幼鱼生长几乎没有影响。后续将继续开展刀鲚幼鱼的耳石锶标记效果检验，判断安全浓度下最佳标记效果，为今后的增殖放流标记方法选择提供理论支撑。