2型糖尿病小鼠模型的建立

左心真，王蒙蒙，董晓

(青岛农业大学生命科学学院，山东青岛 266109)

随着社会经济的发展和人民生活水平的提高，目前整个社会肥胖问题日益严重，糖尿病患病人数逐年递增。据国际糖尿病联盟(IDF)最新发布的结果显示，在全球范围内糖尿病患者平均增长率为51%，其中中国的糖尿病患者人数最多，约为1.164亿人[1]。我国糖尿病患者以2型糖尿病为主，约占患病总人数的90%以上。糖尿病是一种自身葡萄糖代谢紊乱性疾病，现有的治疗策略无法阻止该病和相关并发症的发生。糖尿病主要分为1型和2型两种类型，区分这两种糖尿病的关键在于有无胰岛β细胞抗原的自身抗体，有自身抗体的是1型糖尿病(T1D),且确诊时年龄较小，跟遗传因素有关；无自身抗体的是2型糖尿病(T2D)[2]。T2D的发病机制是胰岛功能缺陷和胰岛素抵抗两个方面。所谓胰岛素抵抗是胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率下降，机体代偿性地分泌过多胰岛素产生高胰岛素血症，以维持血糖的稳定。通常来说，2型糖尿病患者需要胰岛β细胞分泌更多的胰岛素来降低血糖的含量，但是β细胞并不能分泌过多的胰岛素，从而出现胰岛素分泌不足的现象，导致患者血糖偏高。2型糖尿病会出现颈动脉粥样硬化性病变、脂代谢异常、脂肪肝等一系列并发症[3]，因此建立一种类似2型糖尿病患者的小鼠模型并进行相关研究对临床上治疗糖尿病具有重大意义。

链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)是一种DNA烷基化试剂(氨基葡萄糖-亚硝基脲)，只对胰腺β细胞有高选择的毒性作用。STZ通过葡萄糖转运蛋白2(glucose transport protein type 2，GLUT2)进入胰岛β细胞，破坏β细胞的结构，从而减少胰岛素释放，因此STZ是建立糖尿病模型较为常用的试剂。研究表明，高剂量STZ(100～200 mg/kg)并饲喂高热量饮食可致胰岛β细胞发生坏死，严重影响胰岛功能，导致胰岛素分泌不足，进而造成1型糖尿病特征形成；而小剂量STZ对部分胰岛β细胞选择性轻微损伤，可促进β细胞凋亡，能诱导形成T2D模型[4]。高糖高脂饮食与小剂量STZ(40 mg/kg)进行联合诱导而成的糖尿病模型属于当前比较理想的模型[5]。

利用高糖高脂饲料并搭配注射低剂量STZ诱导的小鼠动物模型可以准确模拟2型糖尿病患者体内环境，从而为研究2型糖尿病发病机制和临床治疗提供了真实的动物模型[4]。采用此方法完成造模后的小鼠血糖值大于200 mg/dL，存在胰岛素抵抗和葡萄糖耐受差的情况，与临床患者表现十分相似[6]。这一造模方法模拟了2型糖尿病的疾病发生过程，其代谢现象类似于2型糖尿病晚期患者，是目前应用最为广泛和成熟的造模方法[7]。肝脏是糖代谢的重要器官，肝细胞的葡萄糖摄取、糖原合成等过程都是通过胰岛素介导来实现的。朱俊瑶等[8]认为高脂饮食可引起小鼠皮下脂肪细胞形态和功能异常，不仅促进糖异生，还导致胰岛素信号通路受阻。2型糖尿病早期胰岛素抵抗病理变化的客观基础之一在于脂肪组织在肝脏的沉积和肝脏胰岛素受体的减少[9]。因此，本试验建立2型糖尿病小鼠模型并对其脂肪和肝脏组织进行组织切片和苏木精-伊红染色 ( hematoxylin-eosin staining，HE染色)试验，以进一步证明获得的模型符合2型糖尿病模型要求。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂仪器

1.1.1 实验小鼠及饲料

C57 BL/6J小鼠80只，4周龄，雄性，SPF级，平均体质量16～18 g，购买自济南朋悦实验动物技术有限公司。高糖高脂饲料购买自江苏省协同生物工程有限责任公司，配方为：维持基础料40%+猪油28%+蔗糖10%+全脂奶粉10%+酪蛋白8%+预混料2%+磷酸氢钙2%，真空包装并于4 ℃储存。正常对照组饲喂普通饲料，配方为：玉米粉27%，麸皮19%，大米16%，豆饼16%，鱼粉13%，钙粉3%，骨粉3%，酵母粉2.3%，食盐0.5%，复合维生素0.1%，微量元素0.1%，于室温下储存。

1.1.2 试剂

STZ购买自北京索莱宝(Solarbio)科技有限公司；葡萄糖、柠檬酸、柠檬酸三钠均购买自国药集团化学试剂有限公司；胰岛素注射液购买自南京新百药业有限公司；乙醇购买自烟台三和化学试剂有限公司。

1.1.3 仪器

血糖仪(爱奥乐科技北京有限公司);切片机(德国Leica RM 2235)；医用型一次性无菌注射器[碧迪医疗器械(上海)有限公司]；精密天平SI-234[丹佛仪器(北京有限公司)]。

1.2 试验方法

1.2.1 T2D小鼠模型的建立

对已购买小鼠进行称重，每3只为一笼分笼饲养于25 ℃恒温动物房。先用普通饲料饲养1周，使小鼠适应新的环境，消除运输应激造成的影响。1周后把小鼠随机分成两组，一组为2型糖尿病组(T2D)，60只；一组为正常对照组(CHOW)，20只。 T2D组用高糖高脂饲料喂养，CHOW组则用普通饲料喂养，两组小鼠除饲料喂养条件不同以外其他条件均相同。

小鼠分组后，每周二上午9：00对小鼠体质量和血糖进行测定记录。小鼠饲养20周后，T2D组小鼠按40 mg/kg剂量(为体重剂量，下同)注射STZ，1 d 1次，连续3 d，处理结束后第3天开始尾静脉采血检测小鼠血糖，连续3次检测血糖水平高于200 mg/dL，即可判定为2型糖尿病小鼠模型建成。

1.2.2 对小鼠进行腹腔注射STZ

(1)当饲喂小鼠20周后，检测确定T2D组小鼠血糖水平明显高于CHOW组并趋于稳定，在其血糖水平达到170 mg/dL时，可以对小鼠进行小剂量注射STZ诱导产生2型糖尿病，在注射之前对小鼠禁食12 h。

(2)柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制：缓冲液分为A液和B液，须现配现用。A液：准确称量0.735 g柠檬酸钠溶解在25 mL无菌超纯水中；B液：准确称量0.525 g柠檬酸溶解在25 mL无菌超纯水中。将充分溶解好的A液和B液等体积混匀，再将pH范围调到4.2～4.5。

(3)STZ溶液配制：避光称取0.003、0.004、0.005 g STZ分别溶解在1 mL的上述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，放在冰上，轻轻混匀，配制浓度为3、4、5 mg/mL STZ溶液。

(4)为小鼠注射STZ。称量小鼠体质量，按照1 g体质量分别注射浓度为3、4、5 mg/mL的STZ溶液0.01 mL，使小鼠STZ分别达到30、40 和50 mg/kg剂量，5 min内完成小鼠腹腔注射。

1.2.3 葡萄糖耐量试验和胰岛素耐受试验

试验从下午5：00让小鼠禁食16 h，根据小鼠的体质量，按照2 g/kg的剂量给小鼠腹腔注射浓度为0.2 g/mL葡萄糖溶液，对小鼠进行葡萄糖耐量试验，在葡萄糖注射0、15、30、60、90、120 min后测血糖浓度；48 h后再次对小鼠禁食4 h进行胰岛素耐受试验，根据小鼠的体质量，按照0.75 U/kg的剂量腹腔注射胰岛素溶液，在注射后0、15、30、60、90、120 min后测血糖浓度。

1.2.4 肝脏和脂肪组织切片及HE染色

为了检测T2D组小鼠的脂肪泡直径大小，对两组小鼠进行组织切片和HE染色 。按照组织固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、展片的步骤依次进行；之后进行染色，染色前，将组织切片提前放置在60 ℃烘箱中烘片2 h，使石蜡熔化，将切片放入染色架中进行染色；染色完成后，迅速在组织切片上滴一滴中性树脂，用盖玻片轻轻封片，避免滑片，放入通风橱吹干备用[10]。

1.3 数据处理与分析

本试验采用GraphPad Prism 8.3和Image J软件进行数据分析和作图。两组数据比较均采用t检验法；*表示P<0.05水平上差异显著，**表示P<0.01水平上差异极显著，***表示P<0.001水平上差异极极显著。

2 结果分析

2.1 两组小鼠体表特征的差异

2型糖尿病模型(T2D)的小鼠因饲喂高糖高脂饲料，体质量比正常对照组(CHOW)小鼠增加得快。小鼠饮食高糖高脂饲料20周后，经肉眼观察，CHOW组小鼠(图1A)比T2D组小鼠(图1B)体型小得多，并且前者小鼠毛质光滑顺亮，而T2D组小鼠的毛紧贴皮肤有出油现象。

图1 正常对照组(A)和2型糖尿病诱导组(B) 小鼠在体表特征上的比较

2.2 两组小鼠体质量、血糖水平的比较

在进行高糖高脂饲料喂养之前，正常对照组和T2D组小鼠体质量、血糖并无显著性差异，用高糖高脂饲料喂养20周，T2D组小鼠的血糖和体质量均显著高于CHOW组小鼠(P<0.001)，见表1。

2.3 2型糖尿病小鼠成模率和死亡率的测定

分别用30、40 和50 mg/kg剂量的STZ对T2D组小鼠进行腹腔注射。由图2可看出，注射30 mg/kg剂量的STZ成模率为75%；注射50 mg/kg剂量的STZ死亡率为65%；注射40 mg/kg剂量的STZ死亡率仅为10%，且成模率也最高，为85%，各组死亡率差异性显著。

2.4 葡萄糖耐量试验致两组小鼠葡萄糖耐量能力比较

葡萄糖耐量试验通常作为确诊糖尿病发生的一个重要依据，其机理是检测自身对葡萄糖的负荷能力。两组小鼠同时注射相同剂量葡萄糖溶液后，两组小鼠血糖都有所上升，在30 min时达到最高，之后就开始降低，CHOW组2 h之内恢复到注射前浓度，而T2D组小鼠在2 h内未能恢复到注射前浓度，葡萄糖耐量降低(图3A)。通过计算曲线下面积发现，两组小鼠葡萄糖耐量能力存在显著差异(图3B)。

表1 两组小鼠体质量、血糖水平的比较

图2 注射不同剂量STZ 对 T2D小鼠成模率(A) 和死亡率(B) 的影响

2.5 胰岛素耐受试验致两组小鼠胰岛素抵抗能力的比较

对两组小鼠进行胰岛素溶液注射后，CHOW组小鼠的血糖浓度在30 min时达到最低值(图4A)，之后快速恢复，在90 min时基本恢复到注射前血糖水平。T2D组小鼠注射胰岛素溶液后，血糖浓度下降的速度明显慢于CHOW组，在60 min左右达到最低，之后缓慢上升，在2 h之内没有恢复到初始血糖浓度，表示已经发生胰岛素抵抗现象。通过统计曲线上面积发现，两组小鼠胰岛素耐受能力存在显著差异，符合2型糖尿病模型要求(见图4B)。

图3 葡萄糖耐量试验致两组小鼠葡萄糖耐量能力的比较

2.6 两组小鼠脂肪和肝脏组织切片及HE染色结果比较

取两组小鼠腹股沟脂肪，通过脂肪组织切片和HE染色试验发现，T2D组小鼠(图5A)脂肪组织的脂肪泡面积大于CHOW组小鼠(图5B)，有显著性差异(图5C)。取两组小鼠肝脏，通过肝脏组织切片和HE染色试验发现，T2D组小鼠(图5D)肝脏组织的脂肪泡面积大于CHOW组小鼠(图5E)，并且脂肪泡的数量明显多于CHOW组小鼠，有显著性差异(图5F)。

图4 胰岛素耐受试验致两组小鼠胰岛素抵抗能力的比较

A：T2D组脂肪组织HE染色；B: CHOW组脂肪组织HE染色；C: 两组小鼠脂肪组织的脂肪泡直径统计；D: T2D组肝脏组织HE染色; E: CHOW组肝脏组织HE染色; F: 两组小鼠肝脏组织的脂肪泡直径统计

3 讨论

2型糖尿病的胰岛素抵抗是一种病理状态，在这种状态下，胰岛素不能对正常的胰岛素水平做出适当的反应。胰岛素抵抗是胰岛素依赖细胞(如脂肪细胞等)对胰岛素不适当反应的复杂病理状态，它是高血压、血脂异常、糖耐量异常、冠心病、脑血管病等多种慢性病的基础[11]。长期、过量高脂高糖食物的摄入会损伤胰岛细胞，从而出现糖尿病。本研究利用以上原理，通过高糖高脂饲料饮食并与小剂量STZ联合进行诱导，构建了肥胖相关的2型糖尿病小鼠模型。将小鼠高糖高脂喂养20周后，T2D组小鼠血糖水平明显高于CHOW组，在血糖值达到170 mg/dL后连续3 d注射40 mg/kg剂量的STZ，使建立的糖尿病模型更接近于人类2型糖尿病患者[12]。有研究报道，使用STZ剂量为30 mg/kg进行诱导，可以成功地建立T2D动物模型[13]；另有研究表明，持续高糖高脂饮食12周能够诱导大鼠出现糖调节受损、胰岛分泌功能减退以及脂代谢紊乱，且高脂联合注射30 mg/kg剂量的STZ后，糖尿病大鼠的上述受损幅度明显加大[14]。也有研究采用4周龄SPF级SD大鼠(斯普拉格-杜勒鼠)高糖高脂饲料喂养1个月, 按30 mg/kg剂量一次性腹腔注射STZ，从而建立稳定的具有高血脂和胰岛素抵抗特征的2型糖尿病动物模型，但此文章未明确表述2型糖尿病动物模型的成模率和存活率[15]。以上报道与本试验所用STZ剂量不一致，可能与STZ的注射频率不一样，或与实验动物品系不同等有关。综上所述，本试验通过高糖高脂饲料喂养并与注射小剂量STZ(40 mg/kg)联合进行诱导建立的2型糖尿病小鼠造模方法具有实验周期短、方法简便、相对可靠稳定、造模成本低等优点。

本研究中葡萄糖耐量试验和胰岛素耐受试验结果显示，T2D组小鼠在注射葡萄糖后血糖迅速上升，达到最高之后缓慢下降，在2 h内未能恢复到注射前浓度，葡萄糖耐量降低；T2D组小鼠注射胰岛素溶液后，血糖下降速度较CHOW组慢，在达到最低之后缓慢上升，在2 h之内没有恢复到注射胰岛素溶液前血糖浓度，发生了胰岛素抵抗现象，这说明2型糖尿病小鼠模型建立成功[12]。刘丽萍等[16]用高糖饲料喂养SD雄性大鼠6周后，对其进行葡萄糖耐量试验和胰岛素耐受试验，发现处理组在50 min时血糖浓度最低，90 min 后血糖未能恢复，说明高脂饲料喂养SD大鼠6周后会出现糖耐量、胰岛素耐受异常，即具有胰岛素抵抗的特征，这和本试验结果一致。进一步对两组小鼠脂肪和肝脏进行组织切片及HE染色分析，发现T2D组小鼠的脂肪和肝脏中的脂肪泡面积明显大于CHOW组小鼠，存在显著性差异。薛莱等[17]经过高脂饲料联合多次小剂量STZ诱导小鼠糖尿病模型形成4周后，通过 HE染色发现T2D小鼠肝小叶结构破坏明显、肝索排列混乱、肝细胞出现大量脂肪空泡，说明2型糖尿病(非酒精性)脂肪肝模型建立成功，这与本试验结果相符。

综上所述，4周龄C57BL/6雄性小鼠用高糖高脂饲料喂养20周后，再腹腔注射40 mg/kg体重剂量的STZ，能形成稳定的2型糖尿病模型，并且操作简单，成模率和存活率达80%以上。本试验为日后治疗和研究2型糖尿病提供了一种建立动物模型的方法。