乙醇强还原土壤灭菌法对番茄连作土壤微生物和理化指标的影响

王英磊，王策，刘耀臣，孙丰宝，李敏

(1.烟台市农业技术推广中心，山东烟台 264000; 2.青岛农业大学园艺学院，山东青岛 266109)

连作障碍已成为制约我国设施蔬菜生产的严重问题，土传病害是造成蔬菜连作障碍的最重要因素，严重制约了蔬菜产业的发展。防治土传病害常采用的高温闷棚等物理防治措施对温度要求苛刻[1]；药物熏蒸等化学防治措施存在食品与环境安全问题[2]；微生物菌剂等生物防治措施成本较高且效果不稳定，因此，寻求新的绿色土壤灭菌方法十分必要。日本、荷兰科学工作者[3-4]受水稻轮作种植的启发，在21世纪初提出了一种强还原土壤灭菌法(reductive soil disinfestation, RSD)，也称生物土壤灭菌法(biological soil disinfestation, BSD)。Momma等[5]利用麦麸发酵后所产生的乙醇成分进行土壤消毒，发现乙醇能起到消灭菌虫的作用；而后进一步确定低浓度乙醇可以起到土壤消毒的作用，消毒功效与传统化学方法相当[6]，并发现土壤微生物参与消毒过程，于是在日本全国范围内开展了利用低浓度乙醇作为碳源的强还原土壤消毒工作[7]。我国学者向土壤中施加不同种类、不同比例的有机物料，发现RSD法可以显著抑制土壤病原菌[8-9]。施加固体有机物料可以显著抑制土壤病原物，但相较于液体物料，固体物料需要借助机械施加且不易被施加到深层土壤中[5]。施用低浓度乙醇进行土壤灭菌可以显著抑制再植苹果树病原物[10]、番茄尖孢镰刀菌[5]和草莓大丽轮枝菌[11]。

本研究基于RSD法的特点，针对我国设施蔬菜传统的栽培模式，以绿色无害化防控设施蔬菜土传病虫害为目标，探究低浓度乙醇强还原土壤灭菌法(Et-RSD)对土壤微生物群落结构的影响，以期为实现减肥、减药、增效，无害化防控设施蔬菜土传病害提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试土壤

供试土壤取自山东省海阳市赵疃镇东村庄(36°44′N，120°55′E) 连作5年番茄的日光温室。采用五点取样法取样，剔除杂物后运回实验室备用。土壤基础理化性质如下：全氮含量1.3 g·kg-1，碱解氮含量150 mg·kg-1，全磷含量4.2 g·kg-1，速效磷含量114 mg·kg-1，全钾含量26 g·kg-1，速效钾含量263 mg·kg-1，pH值6.51，土壤电导率(EC)值 487 μS·cm-1。

1.2 试验设计

试验在恒温培养箱中进行。取连作土壤，拣除大石块和根系等杂物，过筛，晾干后装入20 cm ×30 cm的透明密封袋内，每袋装入连作土壤1 kg。每袋分别加入不同浓度(0、0.5%、1%、2%、4%)的乙醇溶液(乙醇浓度均为体积分数，0为纯净水，即对照)150 mL混合均匀，密封，放置于恒温恒湿培养箱，黑暗培养，恒温30 ℃。分别于10 d、15 d、20 d分批取出测定各项指标。共15个处理，每个处理设置3次重复。

1.3 试验方法

1.3.1 微生物及线虫培养和计数

真菌采用PDA培养基培养；细菌采用NA培养基培养；放线菌采用高氏1号培养基培养；尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)采用传统平板培养法，用尖孢镰刀菌专性培养基分离培养[12]；疫霉菌(Phytophthora)采用选择性培养基分离培养[13]。

微生物数量均采用平板稀释计数法[14]。土壤中线虫的分离和计数：采用淘洗-过筛法和过筛-贝曼漏斗法对混合土样中的孢囊和二龄幼虫进行定量分离，在解剖镜下对孢囊和杀死固定的二龄幼虫进行观察并计数[15]。

1.3.2 土壤理化指标测定

参照鲁如坤[16]的方法：MP523-01型pH计(上海三信)按水土质量比2∶1测定土壤pH值；采用DDS-307型电导仪(上海仪电科学仪器股份有限公司)按水土质量比2∶1测定土壤EC值；用1260 Infinity 高效液相色谱仪(Agilent，德国)测定土壤乙酸含量。土壤氧化还原电位采用FJA-6氧化还原电位仪(南京传滴仪器设备有限公司)测定。

1.4 数据分析

运用DPS v7.05软件将数据进行整合分析，用LSD法进行多重比较分析，显著水平P<0.05，图表采用Microsoft Excel 2019制作。

2 结果与分析

2.1 不同浓度乙醇和处理时间对番茄连作土壤微生物数量的影响

当相同乙醇浓度处理下，随着处理时间的延长，连作番茄土壤可培养真菌的数量逐渐降低(图1A)，可培养细菌(图1B)和可培养放线菌(图1C)数量逐渐升高。当处理10 d时，1%处理土壤可培养真菌数量显著低于对照，其余浓度与对照差异不显著；处理时间为15 d和20 d的趋势相同，2%和4%乙醇处理的可培养真菌数量显著低于对照，4%乙醇处理20 d的土壤中可培养真菌数量最低，与2%乙醇处理20 d差异不显著，二者分别比 10 d对照处理降低了59.8%和56.0%。

当处理10 d时，除0.5%乙醇外，其他浓度处理细菌数量显著高于对照；处理15 d和20 d的土壤细菌数量与10 d的趋势相似，其中4%乙醇处理20 d的土壤中可培养细菌数量最高，且与2%浓度处理20 d和4%乙醇处理15 d差异不显著，三者分别比10 d对照处理增加了380.4%、328.6%和276.8%。

当处理10 d时，随乙醇浓度的增加，放线菌数量逐渐增加，且2%和4 %乙醇放线菌数量显著高于对照；处理15 d和20 d的土壤放线菌数量与10 d的趋势相同，其中4%乙醇处理15 d的土壤中放线菌数量最高，比10 d对照处理增加了618.2%。

以上结果表明低浓度乙醇强还原处理可以减少土壤中真菌的数量，增加土壤中细菌和放线菌的数量。

图1 不同浓度乙醇和不同处理时间对番茄连作土壤微生物数量的影响

2.2 不同浓度乙醇和处理时间对番茄连作土壤病原菌数量的影响

除对照外，当相同乙醇浓度处理时，随着处理时间的延长，番茄连作土壤中尖孢镰刀菌(图2A)和疫霉菌(图2B)数量逐渐降低。当处理时间相同时，随着乙醇浓度的增大，尖孢镰刀菌和疫霉菌数量逐渐降低；4%乙醇处理20 d的病原菌数量最低，二者分别比10 d对照处理降低87.5%和92.0%，2%乙醇处理20 d和4%乙醇处理15 d差异不显著。表明低浓度乙醇强还原处理可以减少土壤中尖孢镰刀菌和疫霉菌数量。

图2 不同浓度乙醇和处理时间对番茄连作土壤尖孢镰刀菌和疫霉菌数量的影响

2.3 不同浓度乙醇和处理时间对番茄连作土壤根结线虫繁殖体数量的影响

当处理时间相同时，随着乙醇浓度的增大，连作番茄土壤中根结线虫二龄幼虫(图3A)和卵囊(图3B)数量呈下降趋势；相同浓度条件下，随处理时间的增加，土壤二龄幼虫和卵囊数量逐渐下降。不同处理时间下，乙醇处理的土壤中二龄幼虫和卵囊数量都显著低于对照，其中4%乙醇处理的土壤中二龄幼虫和卵囊数量最低。处理时间为20 d时，4%乙醇处理的土壤中二龄幼虫和卵囊数量最低，且与2%乙醇处理差异不显著，两个处理浓度下二龄幼虫数分别比10 d对照处理降低86%和79.8%，卵囊数分别降低75.6%和85.0%。表明低浓度乙醇强还原处理可以显著减少土壤中的根结线虫二龄幼虫和卵囊数量。

图3 不同浓度乙醇和处理时间对番茄连作土壤根结线虫二龄幼虫和卵囊数量的影响

2.4 不同乙醇浓度和处理时间对番茄连作土壤可培养微生物比例的影响

由表1可知，低浓度乙醇处理以后番茄连作土壤细菌/真菌(B/F)、放线菌/真菌(A/F)数量比在相同处理时间下，随着乙醇浓度的升高逐渐升高。处理时间为10 d时，4%乙醇处理B/F显著高于对照和0.5%处理，但与1%和2%乙醇间差异不显著；4%乙醇处理A/F与2%处理间差异不显著，但显著高于其他浓度处理。当处理时间为15 d时，4%乙醇处理的B/F和A/F显著高于其他处理，其他处理间的B/F和A/F均不存在显著差异。当处理时间为20 d时，2%和4%乙醇处理的B/F显著高于其他处理；1%、2%和4%乙醇处理A/F显著高于对照和0.5%处理。其中4%乙醇处理15 d和20 d及2%乙醇处理20 d三个处理B/F和A/F显著高于其他处理。说明乙醇强还原处理可以将土壤从“真菌型”土壤转变为“细菌型”土壤。

表1 不同浓度乙醇和不同处理时间对番茄连作土壤微生物结构的影响

2.5 不同浓度乙醇和处理时间对番茄连作土壤理化性质的影响

低浓度乙醇强还原处理对土壤pH、EC等理化指标有一定影响(表2)，在相同处理浓度下，随时间的增加，pH先降低再升高；当处理20 d时，4%乙醇处理的pH显著高于对照。相同处理时间内，不同浓度乙醇处理均能有效降低土壤电导率，4%乙醇处理20 d以后土壤电导率为162 μS·cm-1。在相同处理浓度下，随着处理时间增加，低浓度乙醇处理土壤氧化还原电位显著降低；相同处理时间内乙醇处理土壤氧化还原电位显著低于对照。随处理时间和乙醇浓度的增加，土壤中乙酸含量均有不同程度提高(表2)。

表2 不同浓度乙醇和不同处理时间对番茄连作土壤某些理化指标的影响

3 讨论

已有研究表明[4,7]，RSD法的灭菌机理可能与厌氧状态、有毒有机酸、还原性产物以及土壤微生物群落结构的改变有关。本试验中，随着乙醇浓度和处理时间的增加，土壤pH先降低后升高，氧化还原电位逐渐降低，乙酸含量逐渐增加。这是由于在厌氧条件下长时间的土壤强还原过程中产生大量OH-可以中和酸性土壤，调节土壤pH值，使土壤pH值升高，氧化还原电位降低[17-18]，乙醇在土壤厌氧微生物的作用下发生氧化还原反应转变成乙酸[19-20]。研究表明，强还原过程中产生的某些有机酸，如乙酸和丁酸对镰刀菌具有很强的抑制作用[21-22]，本试验中尖孢镰刀菌数量显著下降，且乙醇浓度越高尖孢镰刀菌数量下降速度越快，可能与乙醇形成的有机酸相关。

土壤微生物群落结构对土壤理化性质和植物生长至关重要，是衡量土壤微生物多样性和肥力的一个重要指标[23]。RSD处理对番茄根际土壤细菌群落组成影响较大[24], 土壤微生物中细菌和放线菌多为促进植物生长的有益菌，如芽孢杆菌和假单胞菌等[25-26]，而植物病害则多是由真菌引起的[27]。本试验表明，随着乙醇浓度和处理时间的增加土壤微生物群落结构发生了一定程度的改变，细菌和放线菌数量增加，真菌数量减少，逐渐向“细菌型”土壤转变，且土壤中的尖孢镰刀菌、疫霉菌和根结线虫数量均显著降低。这是因为强还原处理过程产生的有益菌利用易降解有机碳源大量繁殖，这些有益微生物的拮抗作用、竞争作用及寄生作用能较好地抑制病原菌[8,20,28]。Blok等[4]指出采用固体有机物料的RSD法操作烦琐，Momma等[5]人研究表明低浓度乙醇进行土壤灭菌与有机物料灭菌效果相当。本试验表明2%～4%乙醇溶液处理15～20 d对番茄连作土壤病原物镰刀菌、疫霉菌和根结线虫的抑制作用显著，而2%乙醇处理成本低，因此认为2%乙醇溶液处理20 d为最佳组合。