基于网络药理学探讨薏苡附子败酱散治疗结直肠癌的分子机制研究

吕欣妮 尹佳钰 钱丽君 金梦洁 方志军

南京中医药大学附属中西医结合医院肿瘤科，江苏南京 210028

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是最多见的消化道癌症，具有高患病率、高病死率的特点[1]。当前针对CRC 的现代医学诊疗手段所带来的副作用严重影响患者的生存质量，若耽误治疗进程会缩短生存周期[2]。中医药诊治CRC 的优势不容小觑，其治疗机制具备靶点多位、疗效显著等特征[3]。薏苡附子败酱散作为肠道疾病经典验方，始载于《金匮要略》：“肠痈……薏苡附子败酱散主之”[4]。现代亦有多项研究表明本方治疗CRC 在增效减毒、抑制肿瘤复发与转移方面效果显著[5]。本研究通过网络药理学的研究方式对本方潜在活性化合物多成分、多靶点的作用机制进行初步探索，为其深入研究及广泛应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 薏苡附子败酱散相关靶点选择

通过中药系统药理学数据库（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP）获得3 味中药化学活性成分，依据口服利用度≥30%和类药性≥0.18 两个属性值筛选获取其蛋白靶点并统一于蛋白质数据库（Uniprot）规范。

1.2 CRC相关靶点筛选

以“colorectal cancer”为主题词，于GeneCards数据库中挖掘CRC 有关靶点，再根据Score 值的大小筛选核心靶点。

1.3 蛋白质相互作用网络构建与分析

用Venny 2.1 软件得到药物疾病交集靶点，将交集靶点粘贴至String 11.0，生物种类选人类，设置中等置信度（≥0.9），其余参数不变，构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络。将结果以TSV 格式上传至可视化软件行拓扑分析，据靶点的度值筛选核心基因，度值大小与其在PPI 中的重要程度呈正比[6]。

1.4 基因本体（gene ontology，GO）功能分析和基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

把本方治疗CRC 靶点输入Metascape 在线平台，设定P< 0.01，进行GO 功能分析和KEGG 通路富集分析，并将所得信息可视化。

1.5 药物成分-CRC靶点-通路网络图的建立

借助CytoScape 3.9.0 建立药物成分-CRC 靶点-通路网络图，并分析有效成分及靶点的介度、连接度和紧密度等，根据数值确定核心靶点以及关键生物学通路。

2 结果

2.1 薏苡附子败酱散的活性成分

薏苡仁化学成分38种、附子65种、败酱草52种，筛选后得薏苡仁6 种、附子10 种、败酱草11 种活性成分，见表1。薏苡仁成分对应靶点40个、附子282个、败酱草323 个，归并去重后共获得靶点367 个。

表1 薏苡附子败酱散的活性成分

2.2 CRC相关靶点的获取

于GeneCards 获取CRC 相关靶点10 746 个。为获得相关度更高的靶点，求三次中位数，设Score>11.05 筛选得到1347 个CRC 疾病有关靶点。

2.3 交集靶点的获取及PPI网络的构建

通过韦恩图获取151 个共同靶点基因作为本方抗CRC 的药效靶点，见图1。将交集靶点导入String 11.0 建造PPI，见图2。将PPI 文件做可视化处理，见图3。该网络有151 个节点和6788 条边。拓扑分析后据度值由大到小前五位分别为肿瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（AKT serine/threonine kinase 1，AKT1）、MYC 原癌基因（MYC proto-oncogene，MYC）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）作为本方治疗CRC 的核心靶点。

2.4 靶点功能与通路的富集分析

将151 个交集靶点输入Metascape 平台做GO功能分析和KEGG 通路富集分析。其中生物过程有1238 条，主要与细胞对无机物的反应、蛋白磷酸化、对氮化合物的反应、细胞迁移的正调控、细胞凋亡信号通路等相关。细胞组分有445 条，主要包括膜筏、激素受体复合物、转录调节复合物、蛋白激酶复合物、染色体区。分子功能有783 条，涉及蛋白激酶活性、转录因子结合、蛋白酪氨酸激酶活性、酪氨酸激酶结合蛋白、细胞因子受体结合等。KEGG通路分析结果呈现总牵涉通路268 条，主要富集在癌症通路、乙型肝炎、PI3K-Akt、脂质和动脉粥样硬化、AGE-RAGE 信号通路等。选取P值前20 位关联性较大的通路借助微生信数据分析网站将结果可视化。见图4～5。

2.5 药物成分-CRC靶点-通路网络图的创建

创建药物成分-CRC 靶点-通路网络，见图6。把KEGG 富集分析前20 条通路和对应的蛋白靶点上传并分析网络拓扑学参数，得到核心成分及核心作用靶点。显示槲皮素连接度、介度和紧密度均最高，可预测槲皮素是本方治疗CRC 的首要成分，其次为木犀草素、惰碱、山奈酚，均能与多个靶点交互作用，推测上述组分可能是本方治疗CRC 的主要活性组分，见表2。

表2 薏苡附子败酱散主要活性成分网络节点特征参数

3 讨论

本研究结合CRC 的古今病因辨证，预测本方可能对CRC 起着一定的治疗作用，结合网络药理学，探析具体治疗机制。首先筛出本方治疗CRC 的活性成分为槲皮素、木犀草素、惰碱、山柰酚等。CRC 的相关基础研究表明，槲皮素可利用其对IL-6/STAT3 信号通路的调节，阻碍肿瘤细胞的增生和繁殖[7]。木犀草素能借助ATAD2 蛋白信号传导使MMP-2、MMP-9等促癌靶点的表达下调，同时抑制肠癌HT-29 细胞增殖、转移和上皮间质转化[8]，惰碱及苯甲酰基萘均属于附子生物碱类，通过干预MTAP、ABCB1 基因，调控AKT1、EGFR 蛋白表达，参与磷脂酰肌醇介导的信号转导、雌激素信号通路、中心碳代谢等途径来实现抗肿瘤[9]。山柰酚可上调p53 蛋白表达量并增强磷酸化程度，使Bcl-2 和Bax 蛋白含量发生变化、诱导细胞周期停滞，最终借助线粒体途径、死亡受体途径抑制人结肠癌细胞增殖[10-11]。故推测本方关键依靠槲皮素、木犀草素、惰碱、山柰酚等治疗CRC。

数据分析显示，本方治疗CRC 的靶点首要聚集在TP53，而AKT1 也是紧要靶点之一。TP53 为抑癌基因之一，有实验发现CRC 细胞的外泌体蛋白可抑制CRC 细胞的凋亡，而TP53 基因敲除的样本外泌体蛋白的组成发生改变，主要集中在泛素化、糖酵解通路中，达到改变肿瘤细胞微环境抗肿瘤的目标[12]。多项研究表明AKT1 在CRC 中高表达，通过代谢信号通路，参与调节巨噬细胞的反应及其活化表型，促进CRC 细胞的增殖[13]。本方治疗CRC 的通路主要有癌症的途径、乙型肝炎、PI3K-Akt 信号通路、AGE-RAGE 信号通路等。基于文献搜索显示，PI3K-Akt 信号通路在CRC 方面研究广泛，且其在KEGG 分析结果中排序靠前，推测其与本方治疗CRC 的作用机制相关。有研究表示该信号通路能通过改变通路下游P 糖蛋白表达、调控细胞周期、促使肿瘤血管的生成等多种生物过程来推进CRC的进展与转移[14]，同时增加化疗耐药性[15]。故推测本方可能通过抑制PI3K-Akt 信号通路从而阻止CRC 的进展。

研究最终体现了本方多通路、多靶点结合作用的特质。为临证运用其治疗CRC 提供了科学依据，也为发掘它的潜在作用机制奠定了基础。然而囿于网络药理学方法论的局限性，需要生物学实验及其他实践结果进一步验证本研究结果。