响应面法优化芝麻香型白酒酒醅中阿魏酸的提取工艺

赵巧珍，孟 武 *，刘玉涛，张梦梦，缪坤辰，王文洁，胥鑫钰，李小杰，崔新莹

（1.齐鲁工业大学（山东省科学院）生物工程学院，山东 济南 250353；2.济南趵突泉酿酒有限责任公司，山东 济南 250115）

阿魏酸（ferulic acid，FA），也称为3-甲氧基-4-羟基肉桂酸，结构式C10H10O4，是肉桂酸（也称为3-苯基-2-丙烯酸，桂皮酸）的衍生物之一，是一种酚酸，最初从香阿魏中分离得到[1-2]。阿魏酸因具有强抗氧化[3]和抗炎[4]功能，所以能对阿兹海默症[5]、心脑血管[6]、癌症[7-10]等疾病的预防和治疗起一定的作用。近年来，在食品与饮料行业，将阿魏酸作为健康因子的研究越来越多[11-14]。国内外对于阿魏酸的提取分离方法主要包括渗滤法[15]、CO2超临界萃取法[16]、超声波法[17]以及酶水解法[18]等，但有关芝麻香型白酒酒醅中游离阿魏酸提取的研究还很有限。

我国白酒有十二大香型，其中就包括芝麻香型。芝麻香型白酒是建国后始创于山东的创新香型，并且是鲁酒中的典型代表。其酒体的香气特殊，有类似于烘焙芝麻的气味，而这也是芝麻香命名的由来。芝麻香的独特风味主要是由其特殊工艺而来。芝麻香型白酒具有清蒸续糟、泥底砖窖、麸曲和大曲共用、多微共酵、高氮配料、高温堆积、高温发酵、高温馏酒、发酵周期长、长期储存的工艺特点[19-22]。近年来，对芝麻香型白酒发酵过程中微生物多样性的研究较多[23-27]，但对酒醅发酵过程中非挥发性风味物质的研究较少。

本研究以芝麻香型白酒酒醅为研究对象，采用浸提法提取酒醅中的游离阿魏酸，以游离阿魏酸提取量为评价指标，考察甲醇体积分数、料液比、提取时间以及提取温度对酒醅中游离阿魏酸提取量的影响。在单因素试验的基础上，结合Plackett-Burman试验和响应面Box-Benhnken试验设计优化游离阿魏酸提取工艺，以期为芝麻香型白酒酒醅中游离阿魏酸的提取提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芝麻香型白酒酒醅（芝麻香手工酿造班组入池酒醅）：济南趵突泉酿酒有限责任公司。

阿魏酸（纯度99%）：上海麦克林生化科技有限公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯）：美国TEDIA天地试剂公司。

1.2 仪器与设备

1220 Infinity高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：美国安捷伦科技有限公司；FA2004精密电子天平：天津天马衡基仪器有限公司；LGJ-18A真空冷冻干燥机：北京四环科学仪器厂有限公司；FW-100高速万能粉碎机：北京市永光明医疗仪器有限公司；UPR超纯水机：四川优普超纯科技有限公司；KQ2200E超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；TDL-5-A离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 酒醅游离阿魏酸含量测定

阿魏酸含量测定采用高效液相色谱法。

（1）高效液相色谱分析条件

参考文献[28]测定酚酸类成分的液相色谱方法，并进行了适当的调整。HPLC色谱条件如下：ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温35 ℃；流速1.0 mL/min；进样量10 μL；流动相为乙腈-0.09%磷酸（17∶83，V/V）；等度洗脱，检测波长316 nm。

（2）对照品溶液的配制

准确称取0.010 5 g阿魏酸对照品，置于100 mL棕色量瓶中，加入体积分数为50%甲醇溶液，稀释至刻度，配制质量浓度为105 mg/L的阿魏酸对照品储备液。移液管准确吸取对照品贮备液5 mL，置于50 mL量瓶中，加入体积分数为50%甲醇溶液，稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为10.5 μg/mL游离阿魏酸对照品使用液。

（3）供试品溶液的配制

准确称取干燥酒醅样品1.0 g，置于50 mL离心管中，加入30 mL体积分数为50%甲醇溶液，振荡混匀，超声波法（超声功率100W、超声频率40 kHz）50℃超声20 min，4000 r/min离心10 min，取上清液，用0.45 μm滤膜过滤，得到供HPLC分析的样品供试液。

（4）标准曲线的绘制

用体积分数为50%的甲醇稀释阿魏酸对照品使用液，分别配制成0.315 μg/mL、0.525 μg/mL、1.050 μg/mL、2.100 μg/mL、5.250 μg/mL系列标准阿魏酸溶液，并在优化色谱条件下分别测定3次，并取平均值。以阿魏酸质量浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线，拟合线性回归方程为：y=879.84x-10 548，相关系数为R2=0.999 8。

1.3.2 酒醅游离阿魏酸提取及其含量计算

取保存于-80 ℃冰箱的冻酒醅，冷冻干燥后，用粉碎机粉碎过60目筛，在设计的甲醇体积分数、料液比、提取时间以及提取温度条件下，用超声波法（超声功率100 W、超声频率40 kHz）提取干酒醅中的游离阿魏酸。准确称取1.0 g干酒醅样品，置于50 mL离心管中，加入甲醇溶液加以混匀，超声提取后，在4 000 r/min条件下离心10 min，离心后吸取上清液，用0.45 μm滤膜过滤，供HPLC分析。游离阿魏酸提取量计算公式如下：

式中：C为回归方程计算出的游离阿魏酸含量，μg/mL；m为称量干酒醅样品质量，g；V为甲醇溶剂体积，mL。

1.3.3 酒醅游离阿魏酸提取工艺优化

（1）单因素试验

选取甲醇体积分数、料液比、提取时间以及提取温度为自变量，以游离阿魏酸的提取量作为响应值。各因素的水平梯度设置：甲醇体积分数为30%、40%、50%、60%、70%；料液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g∶mL）；提取时间为5 min、10 min、15 min、20 min、25 min；提取温度为30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃。

（2）Plackett-Burman试验设计

在单因素试验的基础上，采用Plackett-Burma试验设计对甲醇体积分数（A）、料液比（B）、提取时间（C）和提取温度（D）共4个因素进行了评估。以游离阿魏酸的提取量为响应值，对每个因素取高水平和低水平值，筛选影响显著的因子用于后续响应面试验，重复3次。Plackett-Burman试验的因素及水平见表1。

表1 Plackett-Burman试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

（3）Box-Behnken响应面试验设计

在Plackett-Burman试验的基础上，以甲醇体积分数（A）、料液比（B）、提取时间（C）、提取温度（D）为自变量，以游离阿魏酸的提取量（Y）为响应值，采用Box-Behnken试验设计考察各因素对游离阿魏酸提取量的影响程度，进而得出提取酒醅中游离阿魏酸的最佳工艺条件。Box-Behnken试验设计因素与水平见表2。

表2 Box-Benhnken试验设计因素与水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.4 数据处理

所有试验均重复3次，结果用“平均值±标准误差”表示。试验数据采用Excel 365和Origin 2019b进行分析和处理。使用Minitab19.1对Plackett-Burman试验结果进行分析，用Design-Expert 12.0.3对响应面试验进行设计与分析。

2 结果与分析

2.1 酒醅游离阿魏酸提取工艺优化单因素试验

由图1A可知，酒醅中游离阿魏酸提取量随甲醇体积分数的增加先升高后降低，当甲醇体积分数为30%～60%时，阿魏酸提取量随甲醇体积分数的增加而增高；当甲醇体积分数为60%时，阿魏酸提取量最高，为（93.18±0.03）μg/g，当甲醇体积分数＞60%之后，酒醅中游离阿魏酸的提取量反而降低，有可能是因为游离阿魏酸量已经达到了饱和，从而导致了酒醅中游离阿魏酸的提取量降低。因此，最适甲醇体积分数为60%。

由图1B可知，酒醅中游离阿魏酸提取量随料液比的增加先升高后降低，当料液比在1∶10～1∶30（g∶mL）时，阿魏酸提取量随之增高，当料液比为1∶30（g∶mL）时，阿魏酸提取量最高，为（90.67±0.60）μg/g，当料液比在1∶30～1∶50（g∶mL）时，阿魏酸提取量随之降低。这是因为料液比太小时，提取液密度大，甲醇溶剂与酒醅不能充分接触，料液比继续增大，酒醅中游离阿魏酸提取量反而减小，有可能是因为随着料液比的增加，酒醅中的其他物质成分也随着提取出来，造成游离阿魏酸提取量降低。因此，最适料液比为1∶30（g∶mL）。

由图1C可知，随着提取时间的延长，酒醅中游离阿魏酸提取量先升高后降低，当提取时间为5～10 min时，阿魏酸提取量随之增高，在提取时间为10 min时，阿魏酸提取量最高，为（85.62±0.21）μg/g，当提取时间＞10 min之后，阿魏酸提取量随之下降。因为提取时间可能过长，酒醅中的游离阿魏酸部分被氧化分解掉，从而导致提取量减少。因此，最适提取时间为10 min。

由图1D可知，随提取温度的升高，酒醅中游离阿魏酸的提取量先增加后趋于平缓，当提取温度为30～60 ℃时，阿魏酸提取量随之增高，当提取温度为60 ℃时，阿魏酸提取量最高，为（80.86±0.50）μg/g，当提取温度＞60 ℃之后，阿魏酸提取量随之下降。但是温度不宜太高，如果温度过高，阿魏酸的结构可能因热作用而改变，含量会降低。因此，最适提取温度为60 ℃。

图1 不同因素对游离阿魏酸提取效果的影响Fig.1 Effect of different factors on the extraction effect of free ferulic acid

2.2 酒醅游离阿魏酸提取工艺优化Plackett-Burman试验

Plackett-Burman试验结果见表3，使用Minitab软件对表4数据进行回归分析和显著性检验，结果见表4。由表4可知，甲醇体积分数（A）、提取时间（C）对酒醅中游离阿魏酸的提取量有极显著影响（P＜0.01），料液比（B）、提取温度（D）对酒醅中游离阿魏酸提取量有显著影响（P＜0.05）。因此，选择甲醇体积分数、料液比、提取时间以及提取温度4个因素进行Box-Behnken试验。

表3 Plackett-Burman试验设计因素与水平Table 3 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

表4 Plackett-Burman试验回归分析结果Table 4 Regression analysis results of Plackett-Burman experiments

2.3 酒醅游离阿魏酸提取工艺优化Box-Behnken试验

2.3.1 Box-Behnken试验结果

在Plackett-Burman试验基础上，以甲醇体积分数（A）、料液比（B）、提取时间（C）、提取温度（D）为自变量，以游离阿魏酸提取量（Y）响应值，优化酒醅中游离阿魏酸的提取工艺，采用Box-Behnke试验设计及结果见表5，方差分析见表6。通过Design-Expert 12.0.3对表6数据进行多元线性回归分析，得到二次多项式方程为：Y=91.75-1.18A+4.51B-2.04C+1.72D-1.79AB-0.791 4AC-0.9173AD-0.602 8BC-0.726 5BD-1.56CD-11.15A2-7.51B2-2.57C2-3.96D2

表5 Box-Behnken试验设计与结果Table 5 Design and results of Box-Behnken experiments

由表6可知，模型F值=27.22，P值＜0.01，表明该模型极显著，并且模型的失拟项（P值=0.848 7＞0.05）不显著，表明所选模型具有良好的拟合度，能较好地拟合试验结果。决定系数R2为0.962 6，调整决定系数R2Adj为0.929 1，表示该模型能够解释92.91%的阿魏酸含量变化，进一步表明回归方程具有良好的拟合度。

表6 回归模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression model

续表

由P值可知，在模型中，一次项B、C、D，二次项A2、B2、C2、D2对结果影响极显著（P＜0.01）；一次项A对结果影响显著（P＜0.05），而其他项对结果影响不显著（P＞0.05）。由F值可知，4个因素对游离阿魏酸提取量的影响大小依次为料液比（B）＞提取时间（C）＞提取温度（D）＞甲醇体积分数（A）。

2.3.2 各因素交互作用对游离阿魏酸提取量影响的响应面分析

采用Design-Expert12.0.3软件绘制各因素交互作用对结果影响的响应面及等高线见图2。通过响应面及等高线可以直观地分析各因素及因素之间的交互作用对游离阿魏酸提取量的影响[29]。响应面图中曲线越是弯曲，表明研究因素对结果的影响就愈大，椭圆形等高线表示研究因素之间的交互作用明显，圆形等高线则表示交互作用不明显。每条曲线上的提取质量是相同的，图形颜色从蓝色到红色表示提取质量由少变多，颜色变化越快，坡度越大，即对结果的影响越显著。

由图2可知，甲醇体积分数、料液比、提取时间和提取温度中任意两个变量取0水平时，其余两个变量对酒醅中游离阿魏酸提取量的影响。三维响应面图基本上是抛物形的，在曲面上有最高点，很容易出现最大值。从图2可以看出，AB的响应面曲线最陡，等高线相对较紧密，因此AB的交互作用对酒醅中游离阿魏酸的提取量影响相对显著；CD的交互作用对酒醅中游离阿魏酸的提取量也有一定的影响；AC、AD、BC和BD的响应曲面相对平坦，等高线松散，表明AC、AD、BC和BD的交互作用对酒醅中游离阿魏酸提取量的有较小的影响。交互作用对酒醅中游离阿魏酸提取量的影响顺序为：AB＞CD＞AD＞AC＞BD＞BC。

图2 各因素交互作用对游离阿魏酸提取效果影响的响应面及等高线Fig.2 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on the extraction effect of free ferulic acid

2.3.3 最佳条件的预测及验证试验

通过回归模型预测得到芝麻香型白酒酒醅中游离阿魏酸的提取最佳工艺为：甲醇体积分数59.28%、料液比1∶33.152（g∶mL）、提取时间7.432 min以及提取温度62.984 ℃。此时酒醅中游离阿魏酸提取量理论值为93.285 μg/g。考虑到试验的客观条件以及操作简便性，因此改进后的最佳条件为：甲醇体积分数60%、料液比1∶30（g∶mL）、提取时间7.5 min、提取温度63 ℃。在此最佳提取工艺条件下进行3次平行验证试验，酒醅中游离阿魏酸的提取量实际值为（91.50±2.99）μg/g，与预测值93.285 μg/g误差值为1.91%，说明试验所得数学模型可以较好的预测各因素和评价指标之间关系，适用于该酒醅游离阿魏酸提取工艺优化。

3 结论

通过单因素试验和Plackett-Burman试验设计及Box-Behnken试验设计，确定酒醅中游离阿魏酸提取过程中的各个因素对游离阿魏酸提取量的影响力大小依次为甲醇体积分数＞提取时间＞提取温度＞料液比。最佳提取工艺条件为：甲醇体积分数60%、料液比1∶30（g∶mL）、提取时间7.5 min、提取温度63 ℃。在此最佳提取工艺条件下，游离阿魏酸提取量实际值为（91.50±2.99）μg/g，较优化前提高13%。实测值与理论值总体吻合，说明模型可以较好的预测响应值，优化条件可靠，具有实际应用价值。