D-半乳糖法制备AD 动物模型的分类总结与初步评价

魏玉婷,朱田田,苏明莉,贾静,严兴科

(甘肃中医药大学针灸推拿学院,兰州 730000)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种病情进行性加重的大脑神经退行性疾病,严重影响着老年群体的身心健康和生活质量[1-2]。调查显示,我国AD 患者已超过1000 万[3],占全球病例总数的25%[4]。现代医学认为各脑区不同程度的萎缩、细胞外间隙β 淀粉样蛋白(amyloid beta protein,Aβ)沉积形成的老年斑(senile plaque,SP)及细胞内Tau 蛋白磷酸化引起的神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)是AD 的主要病理特征[5-7]。目前,AD 的确切病因及发病机制尚无定论,国内外暂无特效治疗手段,故建立具备AD 行为学表现、病理学特征的动物模型对阐明该病的病理机制及新药研发等具有重要的意义。

近年来,常用的AD 动物模型包括以自然衰老、快速老化(SAM 小鼠)、转基因为代表的先天性AD模型,这类模型能较为全面的模拟AD 患者的行为学、生化及病理学改变特征[8],但同时因自然衰老模型需将大小鼠维持饲养至18～24 月龄,建模时间长,且随着老鼠逐渐进入老龄状态,自身状态随之变差,增加了实验过程中动物死亡的概率[9];快速老化模型属近交系鼠群,其繁殖能力较差,来源较局限;转基因模型价格昂贵等,在一定程度上限制了各模型的使用范围。此外,也有通过物理或化学方法构建的后天性AD 模型,如损伤胆碱能系统、注射神经毒性药物等,但这些单一的模型复制方法,只能从某一角度反映AD 的病理机制,未能较为全面的呈现出AD 多病理改变的特征。近年来,复合式造模法因可模拟AD 多因素致病的特点,成为当前AD 动物模型研究的热点。其中以D-半乳糖(D-galactose,D-gal)诱导的衰老模型为基础配合具有神经毒性的药物共同制备的AD 动物模型最为常见。本文从行为学及病理学改变角度对D-gal 及其结合其他药物制备的后天性AD 模型进行了总结和评价,以期为该疾病今后的深入研究提供参考。

1 单纯D-gal 诱导的AD 动物模型

1.1 D-gal 诱发衰老的机理

研究表明,长期服用D-gal,会导致啮齿类动物体内代谢异常,氧化应激增强,神经元数量减少及结构损伤[10-12],多用于制备大脑老化和抗衰老药理研究的动物模型[13-14]。D-gal 诱发衰老的主要机制为长期大量注射该物质能使体内产生过多的活性氧(reactive oxygen species,ROS)[15],造成各器官抗氧化酶超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)等活性降低,导致机体对自由基的清除能力下降,体内自由基的大量堆积破坏了细胞结构和功能,使得机体多器官、多系统功能减退[16-17]。此外,D-gal 致衰老的机制也与免疫缺陷、炎症反应、线粒体功能障碍、端粒缩短等相关[18-19]。

1.2 D-gal 复制AD 动物模型

研究发现,D-gal 诱导的动物模型除衰老外,还会出现认知、记忆障碍的行为学表现及胆碱能神经元减少、Aβ 免疫反应物的聚集等病理变化[20]。单独使用D-gal 制备的AD 动物模型,用药剂量在100～200 mg/kg,造模周期约为6～12 周。

(1)调控Aβ、Tau 蛋白的表达,破坏神经元结构

D-gal 干预可造成Aβ、Tau 蛋白的异常表达、神经元损伤。Yu 等[21]观察了D-gal 对大鼠的影响。经Morris 水迷宫测试,发现模型大鼠逃避潜伏期延长、目标象限停留时间减少,同时出现海马CA1 区树突棘密度降低,Tau 蛋白过度磷酸化水平升高,突触相关蛋白表达下降、细胞自噬活性异常的病理改变。杜艳军等[22]发现,D-gal 会造成海马区突触损伤、神经元丢失及Aβ 的高表达,但未明确指出是否形成SP。郑清等[23]的研究证实,D-gal 干预后的大鼠兴奋性降低、探究及认知功能减退,其海马区突触数量减少,双螺旋细丝蛋白-1(PHF-1)沉积,而PHF 是NFTs 的主要成分之一。Liang 等[24]的研究表明D-gal 长期刺激会造成海马区Aβ 蛋白的沉积。

(2)诱导氧化应激、炎症反应

D-gal 复制的AD 动物模型表现出机体氧化应激及中枢炎症反应的病理改变。Budni 等[25-26]研究发现,D-gal 灌胃4 周后,大鼠出现习惯记忆及自发探索功能减退,6 周后表现出空间记忆障碍,其前额叶皮质和海马体中线粒体呼吸链复合物的活性增加,促使机体产生大量的ROS,出现过氧化反应,证实了氧化损伤与AD 模型认知障碍的相关性,并指出线粒体能量代谢的异常可能是引起机体氧化损伤造成AD 的分子机制之一。Ali 等[27]的研究也明确了这种模型复制方法会损伤白化小鼠的空间学习及短时记忆功能,诱导细胞氧化应激损伤。此外,该研究也指出D-gal 干预会刺激促炎因子如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)等的释放,诱发或加重机体的炎症反应。Rehman 等[28]发现D-gal 复制的AD 模型,具备学习、记忆受损,运动迟缓的行为学改变,同时也能表现出中枢炎症反应、氧化损伤等病理改变。

此外,He 等[29]的研究表明D-gal 复制的AD 模型动物学习记忆功能的减退可能与其损害肠道菌群,增强促炎调控通路活性,诱发中枢炎症反应,即与肠道微生物-肠-脑轴的失调密切相关。而Mansour 等[30]研究发现,去除雌性大鼠双侧卵巢结合D-gal 腹腔注射后,大鼠也会出现空间学习记忆及自发探索功能的障碍,其机制可能与该造模方法诱导脑组织中Aβ 沉积、Tau 蛋白过度磷酸化;增加NOX-1、TNF-α 等炎症因子的表达;通过提高MPC-1和GluR II 的含量引起兴奋性神经毒性作用以及调控PI3K/Akt/mTOR 信号通路的活性,抑制细胞自噬等相关。提示机体雌激素含量的改变也是导致AD 发生的可能原因。

2 D-gal 为基础的复合式AD 动物模型

除上述单独使用D-gal 建立AD 动物模型外,也有研究在D-gal 诱导动物衰老的基础上,配合具有神经毒性的药物采用复合式方法制备AD 动物模型,主要包括D-gal 联合Aβ 类寡聚体、D-gal 联合三氯化铝(AlCl3)、D-gal 联合亚硝酸钠(NaNO2)。

2.1 D-gal 联合Aβ 类寡聚体

2.1.1 Aβ 类寡聚体诱发AD 的机理

Aβ 是由 β 淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)经γ-分泌酶和β-分泌酶的蛋白水解产生的产物[31]。少量的Aβ 可发挥营养神经细胞和增强突触可塑性的作用,而Aβ 的异常增多及聚集则具有神经毒性作用。按其结构的不同,Aβ 可分为单体、寡聚体和纤维,部分研究认为可溶性寡聚体Aβ 的聚集与AD 患者认知功能障碍关系密切[32-33]。Aβ 寡聚体通过与N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDAR)、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑受体(αamino-3-hydroxy-5-methyL-4-isoxazole-propionic acid receptor,AMPAR)、神经元表面的胰岛素受体(insulin receptor,Ins R)等的结合,借助不同信号通路诱发机体氧化应激反应,导致神经元凋亡,细胞内Aβ 异常沉积,进而使机体认知功能障碍[34]。Dgal 联合Aβ 类寡聚体复制AD 动物模型时,D-gal 剂量为50～150 mg/kg,Aβ 用量为2～5 μL,造模周期约6～7 周。

2.1.2 D-gal 联合Aβ 类寡聚体复制AD 动物模型

(1)促进Aβ 聚集,Tau 蛋白磷酸化,损害神经元结构或功能

D-gal 联合Aβ 类寡聚体的复合式造模方法体现了AD 脑组织中Aβ 聚集、Tau 蛋白磷酸化、神经元损伤的病理学特征。Ye 等[35]发现D-gal 联合Aβ25-35造模后的大鼠空间学习及记忆障碍,检测发现其海马区神经元超微结构受损,磷酸化Tau(p-Tau)蛋白表达增加。Deng 等[36]的研究证实了D-gal 联合Aβ25-35复制的动物模型具备AD 学习记忆功能减退的行为学表现,也符合AD 脑组织中APP、Tau 蛋白表达增加、神经元凋亡的病理特征。张淑萍等[37]的研究表明D-gal 联合Aβ1-42复制的动物模型也会表现出认知功能减退及海马神经元超微结构受损的异常改变,但对Aβ1-42的用量未进行说明。

(2)破坏胆碱能系统,降低抗氧化功能,引起炎症反应

D-gal 联合Aβ 类寡聚体的复合式造模方法模拟了与AD 发病相关的中枢胆碱能功能低下、过氧化损伤及炎症反应假说。王改凤[38]研究发现,D-gal 联合Aβ25-35复制的AD 大鼠模型,学习及空间记忆功能受损,同时其脑组织中乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)活性明显升高,表明大鼠胆碱能系统受损。Zhang 等[39]的实验结果与上述研究一致。同时,两项研究均指出该造模法可破坏大鼠的抗氧化能力,造成过氧化损伤,具体表现为SOD 活性降低,MDA 浓度升高。此外,在前者的研究中还出现了炎性细胞因子TNF-α 及IL-1β 含量显著增多的现象。

2.2 D-gal 联合AlCl3

2.2.1 AlCl3诱发AD 的机理

铝(Al)在体内的蓄积会导致大脑出现氧化损伤、胆碱能功能减退及认知障碍[40]。研究表明,AD患者脑组织中Al 的含量显著升高[41]。Al 诱导AD动物模型的机制为:一方面Al 是促氧剂,可诱导机体组织器官ROS 生成增多,抗氧化酶活性降低,使脂质、蛋白质、核酸的结构和功能异常,导致细胞凋亡或功能丧失,引发AD[42-43];另一方面,Al 通过诱导α-分泌酶和β-分泌酶的活性,调节APP 的表达和水解过程,增加脑组织 Aβ 的生成,引起AD[44-45]。此外,Al 也可以通过调节蛋白激酶和蛋白磷酸酶的活性,诱导Tau 蛋白过度磷酸化和异常聚集,进而形成NFTs[46]。D-gal 联合AlCl3复制AD动物模型时,不同报道中两者的用量相差较大,造模周期约6～12 周。

2.2.2 D-gal 联合AlCl3复制AD 动物模型

D-gal 联合AlCl3复制的AD 模型可出现Aβ、Tau 蛋白表达增加、神经细胞凋亡、胆碱能系统损伤、氧化应激及炎症反应等病理改变。陈建国等[47]发现D-gal 联合AlCl3制备的AD 大鼠模型学习记忆功能受损,大脑皮质神经元内Tau 蛋白、海马Aβ含量显著增加,匀浆中GSH-Px、SOD 活性下降,MDA 水平增高,表明模型大鼠脑组织中Aβ 等蛋白生成清除机制失衡,机体氧化还原平衡失调。Chiroma 等[48]观察了D-gal 联合AlCl3干预后大鼠的行为学和病理改变,结果显示模型大鼠记忆认知功能减退,海马中Tau 蛋白发生过度磷酸化改变,且神经细胞大量丢失。Mahdi 等[49]的研究也表明该模型复制方法会引起大鼠神经元结构和数量的异常改变,出现氧化应激及炎症反应。Ji 等[50]的研究发现上述造模法建立的AD 模型学习记忆、视觉识别、探索能力减退,同时出现海马神经元突触损伤,AChE 活性增加,促炎因子释放增多,抗氧化物活性降低的病理改变。此外,Song 等[51]也发现D-gal 联合AlCl3干预会影响小鼠脑组织内神经递质的释放以及肠道菌群的紊乱,这些也被证实与AD 的发生发展密切相关。

2.3 D-gal 联合亚硝酸钠(NaNO2)

2.3.1 NaNO2诱发AD 的机理

NaNO2是一种氧化剂,机体持续摄入会诱导血红蛋白中的二价铁氧化成为三价铁,形成高铁血红蛋白,促使组织缺氧,引起细胞内的游离Ca2+增多、自由基生成增加。一方面这将诱导机体发生氧化应激,导致蛋白磷酸酯酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)活性下降,引起神经元骨架蛋白的过度磷酸;另一方面将促进NFTS的形成。此外,在酸性环境下NaNO2易转化成NO,NO 与超氧阴离子结合生成过氧亚硝酸盐,NO 和过氧亚硝酸盐可以诱导Tau 蛋白的过度磷酸化,诱导AD 的发生[52-53]。D-gal 联合NaNO2复制AD 动物模型时,药物用量多集中在D-gal 120 mg/kg 和NaNO290 mg/kg,造模周期为60 d。

2.3.2 D-gal 联合NaNO2复制AD 动物模型

D-gal 联合NaNO2复制的AD 动物模型多体现出胆碱能系统损伤、中枢炎症反应、氧化应激的病理特征。周张玖智等[54]通过D-gal 联合NaNO2复合干预建立的AD 模型学习记忆障碍,皮层组织中MDA、IL-6、TNF-α 含量显著升高,SOD、GSH-Px 活性降低,表明该模型体内自由基平衡失调,促炎因子释放增加。Zhang 等[55]的研究证实了如前所述复制的AD 模型表现出神经炎症反应及氧化/抗氧化失衡的病理改变,同时,大鼠额叶皮质和海马中AChE 水平升高,Ach 和ChE 含量降低,表明该模型胆碱能系统也受到损害。Wang 等[56]发现,当D-gal的用量为每小时1250 mg/kg,会代偿性上调脑组织中SOD 活性及GSH 水平,并会诱导海马CA1、CA3、CA4 区神经元损伤。

根据现有文献,总结了上述几种AD 动物模型的制备方法、行为学表现和病理改变(见表1),梳理了不同AD 动物模型的模型特征(见表2)。

表1 D-半乳糖法制备AD 动物模型的具体方法、行为学表现、病理改变Table 1 Specific methods,behavioral manifestations and pathological changes of ad animal model prepared by D-galactose method

续表1

续表1

表2 D-半乳糖法制备的AD 动物模型特征总结Table 2 Summary of characteristics of AD animal model prepared by D-galactose method

3 结语

复制具备AD 行为学表现和病理生化特征的动物模型是当今研发治疗AD 新药物、探索新疗法的重要手段和载体。现常用的以D-gal 为基础的AD动物模型制备以单纯D-gal、D-gal 联合Aβ 类寡聚体、D-gal 联合AlCl3及D-gal 联合NaNO2为主。

从病程发展看,D-gal 干预致衰老接近AD 慢性起病的过程。从行为学表现看,上述诸法复制的动物模型均能体现出学习障碍、记忆受损、行为异常等与临床AD 患者相类似的表现。从病理生化改变看,诸法虽未能彻底满足各假说支撑下AD 的发病机制,但也体现出该病多因素致病的特点。首先,各造模法的共同点在于均能诱导机体发生氧化应激、炎症反应,故均可适用于研究AD 患者氧化反应、神经炎症的内在机制及研发抗氧化、抑制神经炎症的相关药物。此外,D-gal、D-gal 联合Aβ 类寡聚体、D-gal 联合AlCl3可模拟AD 神经元损伤、Aβ聚集和Tau 蛋白过度磷酸化的病理改变,可用于研究AD 神经元结构受损或功能障碍及Aβ、Tau 病理产物异常表达的内在机制及多靶向药物干预AD 的作用机制。D-gal 联合Aβ 类寡聚体、D-gal 联合AlCl3、D-gal 联合NaNO2也能破坏胆碱能功能,重现AD 胆碱能系统紊乱的病理特征,适用于研究胆碱能系统损伤与AD 发病相关的神经机制及探讨拟胆碱药物的疗效评价。D-gal、D-gal 联合AlCl3涉及肠道菌群失调的相关表现,可用于一些通过调节肠道菌群改善AD 相关药物的内在机制探讨。相比较而言,D-gal 结合Aβ 类寡聚体、AlCl3复制的模型病理特征更清晰,考虑到前者模型制备复杂,成功率低,故D-gal 结合AlCl3复制的模型适用性最高。

但上述诸法也存在一定的局限性。首先,虽有个别文献提到单纯D-gal 刺激会形成NFTs 的主要成分PHF,但其内在机制尚不明确,结合该药物诱导衰老的相关研究,推断其作用的主要靶点是诱导机体的氧化应激、炎症反应等,而不是影响体内Aβ或Tau 蛋白的产生及代谢过程。Aβ 类寡聚体可直接模拟AD 的特征性病理改变,但不敢保证体外给药与机体之间的相互作用和机体因病变生成病理产物影响其功能的作用机理相一致;同时作为一种创伤性刺激,易对周边脑组织产生损伤。NaNO2本身是一种氧化剂,其诱导的Tau 蛋白过度磷酸化不能排除是破坏氧化还原平衡产生的后效应。AlCl3能同时调节Aβ 的生成及Tau 蛋白磷酸化和聚集过程,相比较而言,能较好的反映AD 特有病理改变的内在机制。总体而言,D-gal、Aβ 类寡聚体、AlCl3、NaNO2均直接或间接参与调控Aβ 高表达、Tau 蛋白过度磷酸化的过程,但诸法均未明确指出在AD动物模型中是否出现SP、NFTs,推测可能与模型复制中药物用量及造模周期的长短相关,药物剂量小,干预时间短,在一定程度上,可能会导致沉积在各脑区的Aβ 经机体内特定的降解酶所降解或者Tau 蛋白磷酸化/去磷酸化的酶系统活性尚未受到严重影响,使得沉积的Aβ 或过度磷酸化的Tau 蛋白不足以形成SP 或NFTs。故在原有研究的基础上,加设干预药物的不同剂量组别及延长建模周期,以此明确各造模法是否具备AD 的典型病理改变,会成为今后新的研究方向。有研究认为,轻度认知功能障碍(mild cognitive impairment,MCI)作为AD 的早期阶段,其动物模型与AD 动物模型相比,应具备早于AD 的发病年龄、轻微的认知减退及轻度的病理生化改变[57]。已有文献报道了用D-gal 配合高脂饲料喂养构建MCI 动物模型的相关研究[58],这是否意味着上述诸法在控制动物大小、用药剂量及造模时间的条件下,可以构建出较为理想的MCI 动物模型。其次,各模型制备方法选用的动物种类及年龄不尽相同,一方面无法确定诱导AD 的药物干预哪一类型的实验动物时导致的病理变化与人体更接近;另一方面,不同年龄的实验动物对致AD 药物的耐受性不同,引起的模型动物生化及病理改变不同。研究发现,对3 月龄大鼠进行D-gal 干预后诱导衰老的模型最接近自然衰老,造模效果好于小于3 月龄的大鼠[59]。

综上,D-gal 为基础的复合式AD 模型复制方法是近年来研究者探索较多的内容,结合各实验动物、药物自身结构和特征,进行大量实验研究后,总结出制备AD 动物模型相对统一的动物种类、药物用量、给药方式、给药周期及各模型动物相对特异性的行为学、生化及病理改变是今后研究的重点。