超声辅助提取茄皮酚工艺优化及其降血糖功效研究

2022-12-10关玉婷陈瑞瑞蔡如玉张紫阳常世敏

食品工业科技 2022年24期

关玉婷，陈瑞瑞, ，蔡如玉，范蓓，孙晶，张瑞，张紫阳，常世敏,

（1.河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北邯郸 056038；2.邯郸市天然产物与功能食品开发重点实验室，河北邯郸 056038；3.中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193）

茄（Solanum melongenaL.）为茄科，茄属植物，在我国广泛种植，是一种高产作物，茄子的不同部位，如皮、肉和叶子，都含有丰富的生物活性物质，如类黄酮和酚类化合物。然而茄皮通常被当做垃圾进行处理，造成严重的环境问题和经济浪费[1]。茄皮作为一种副产品，含有丰富的酚类化合物，具有显著的抗氧化[2]、降血糖[3]和抑菌[4]等作用。将茄皮中的多酚进行提取，可提升茄子的附加值并降低环境压力。

Ⅱ型糖尿病是常见的代谢性疾病，对全球人民健康造成了巨大的威胁。国际糖尿病联合会公布2019年有4.63亿人（占全球人口的9.3%）患有糖尿病[5]。Ⅱ型糖尿病是由多种因素引起的代谢紊乱性疾病，例如遗传、生活习惯和环境等，其特征是缺乏胰岛素或胰岛素水平较低，导致血糖水平异常升高[6]。临床治疗Ⅱ型糖尿病常选用阿卡波糖或二甲双胍等药物，但患者会出现呕吐、腹泻等症状[7]，因此选用天然产物调控血糖水平具有重要意义。赵艳威等[8]研究表明苹果多酚可通过抑制α-葡糖苷酶活性降低糖尿病大鼠的血糖。厉成玲等[9]研究发现黑米多酚可有效刺激小鼠胰岛素分泌，改善Ⅱ型糖尿病小鼠恢复趋于正常血糖水平。

本研究采用超声辅助提取技术制备茄皮酚（EPP），以得率为指标对提取工艺进行优化，测定EPP对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率，评价其体外的降血糖作用，通过建立糖尿病小鼠模型，对EPP体内降血糖活性进行研究，既提升了茄皮的综合利用率，又为治疗Ⅱ型糖尿病提供了新的原料和思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

雄性昆明小鼠实验动物饲养于北京市实验动物研究中心，4周龄（18～20 g），动物许可证号为SYXK（京）2020-0038，实验期间充分保证了实验动物的各项福利；紫黑色茄子表皮颜色均匀无虫害，购于邯郸市丛台区美食林超市；硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖、阿卡波糖、α-葡萄糖苷酶（10 U/mg）上海源叶生物科技有限公司；四氧嘧啶美国Sigma公司；磷酸钾、碳酸钠分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

SB25-12DTD超声波清洗器、SCIENTZ-18N冷冻干燥机宁波新芝生物科技股份有限公司；BPG-9100BH高热鼓风干燥箱上海一恒科技有限公司；AL204型精密电子天平梅特勒-托利多公司；SIGMA3K15台式冷冻离心机曦瑪离心机（扬州）有限公司；UV-80005紫外分光光度计上海方析仪器有限公司；ACCU-CHEK血糖测定仪罗氏血糖健康医护公司。

1.2 实验方法

1.2.1 EPP提取将新鲜无虫害茄子进行清洗，取茄皮置于45 ℃鼓风干燥箱中干燥5 h，干燥后的茄皮进行粉碎并过100目筛。在装有100 mL蒸馏水的锥形瓶中加入2.00 g干燥茄皮粉末，进行超声辅助提取，超声功率为420 W，提取30 min，结束后，8500 r/min离心15 min，收集上清液，冷冻干燥，得到EPP，称重并计算得率。

式中：Y为EPP得率，%；M1为EPP的质量，g；M0为茄皮粉末的质量，g。

1.2.2 单因素实验以EPP的得率为指标，提取时间为50 min，提取温度为45 ℃，料液比为1:50 g/mL，探究最优超声功率（360、420、480、540、600 W）；以EPP的得率为指标，提取时间为50 min，超声功率为480 W，提取温度为45 ℃，探究最优料液比（1:40、1:45、1:50、1:55、1:60 g/mL）；以EPP的得率为指标，提取时间为50 min，超声功率为480 W，料液比为1:50 g/mL，探究最优提取温度（35、40、45、50、55 ℃）；以EPP的得率为指标，超声功率为480 W，提取温度为45 ℃，料液比为1:50 g/mL，探究最优提取时间（30、40、50、60、70 min）。

1.2.3 正交试验在单因素实验基础上，以料液比、提取时间、超声功率和提取温度为因素，EPP得率为指标，采用正交试验L9（34）设计，对影响EPP得率的因素进行优化，见表1。

表1 正交试验因素和水平设计Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 EPP对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率测定根据黄春跃等[10]的方法进行调整，测定EPP对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率。用pH6.9，0.1 mmol/L磷酸盐缓冲溶液分别配制2 mg/mL阿卡波糖溶液、0.2 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液和0.2 mol/L的碳酸钠溶液；配制0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的浓度EPP溶液备用。37 ℃孵育10 min后加入2.0 mL碳酸钠溶液，反应终止后在405 nm处测定吸光值，α-葡萄糖苷酶溶液+EPP溶液吸光值记为OD1，EPP溶液吸光值记为OD2，α-葡萄糖苷酶溶液吸光值记为OD3，磷酸盐缓冲溶液吸光值记为OD4，2 mg/mL阿卡波糖溶液为阳性对照。

α-葡萄糖苷酶抑制率计算公式为：

1.2.5 建立糖尿病小鼠模型所有实验动物均饲养在北京市实验动物研究中心SPF级动物房中，充分保证了实验动物的福利，严格遵守了有关动物使用的道德规定。

随机选120只健康4周龄雄性昆明小鼠，禁食16 h，注射四氧嘧啶180 mg/kg·bw，注射体积为0.01 mL/g，建立Ⅱ型糖尿病模型小鼠；同时给予普通饲料自由采食，禁食8 h，采尾血，测定空腹血糖值。糖尿病小鼠建模成功标准：空腹血糖值大于10 mmol/L（参照《保健食品功能检验与评价方法（2020年版）》）。

1.2.6 降血糖试验随机选取10只健康小鼠作为空白组，选取50只建模成功的小鼠，分为5组（n=10）：空白组（等体积无菌水），阳性对照组（1 mg/kg·bw的阿卡波糖溶液），模型组（等体积无菌水），高剂量组（1.5 g/kg·bw的EPP溶液），中剂量组（0.5 g/kg·bw的EPP溶液），低剂量组（0.25 g/kg·bw的EPP溶液），灌胃体积为10 mL/kg，同时给予普通饲料自由采食，连续灌胃4周，禁食4 h，采尾血，测定空腹血糖值[11]。

式中：W表示血糖下降率，%；BG0表示EPP干预前血糖值，mmol/L；BG1表示EPP干预后血糖值，

mmol/L。

1.2.7 糖耐量试验小鼠试验4周禁食4 h后进行灌胃，20 min后每只小鼠灌胃葡萄糖溶液，剂量为2.0 g/kg·bw，分别测定灌胃后0、0.5、2 h的血糖值并记录血糖曲线下面积[12]。

式中：S表示血糖曲线下的面积；A0表示0 h血糖值；A1表示0.5 h血糖值；A2表示2 h血糖值。

1.3 数据处理

采用SPSS 20.0进行数据处理，显著性差异采用ANOVA，P＜0.05为具有显著性差异，P＜0.01为具有极显著差异，数据表示均采用均值±标准误。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

各因素对EPP得率的影响如图1所示，超声功率对EPP得率的影响呈先上升后下降的趋势，在480 W时，EPP得率最高达到39.21%，因过高的超声功率会造成EPP中黄酮、多酚类物质结构被氧化分解[13]，且过高的超声会产生热效应[14]，改变原料结构，降低了酚类物质的溶出，降低了EPP的得率。

图1 超声功率、料液比、提取温度和提取时间对EPP得率的影响Fig.1 Effects of ultrasonic power, solid-liquid ratio, extraction temperature and extraction time on the yield of EPP

EPP的得率随着料液比的变化呈先上升后下降的趋势，在料液比为1:50 g/mL时得率达到最大，为42.51%。表明料液比为1:50 g/mL时已基本完成对EPP的提取，增加溶剂已无法提升得率，甚至可能会增加冷冻干燥的负荷[15]。故1:50 g/mL为提取EPP的最佳料液比。

EPP的得率随着温度的变化呈先上升后下降的趋势，温度在35～45 ℃时，EPP得率随着温度增加而增加，且提取温度为45 ℃时，EPP得率高达41.2%；当温度高于45 ℃，EPP得率呈下降趋势；过高的提取温度导致EPP中的生物活性物质被分解，且溶剂挥发导致样液溶解度降低，从而降低了EPP的得率[16]，与胡栋宝等[17]的结果一致，利用适宜的提取温度可加快酚类物质溶出，同时需防止过高的提取温度破坏已经提取的多酚类物质。

EPP的得率随着提取时间的变化呈先上升后下降的趋势，当提取时间小于50 min时EPP的得率随提取时间的增加而升高；当提取时间大于50 min时，EPP的得率随提取时间的增加而降低，最优提取时间50 min为，得率为40.11%，与刘静等[18]研究结果一致，过长的提取时间会造成已溶出的EPP被氧化，导致EPP得率会随着提取时间的增加呈现出下降的趋势[19]。故提取EPP最佳超声时间为50 min。

2.2 正交试验结果

由表2、表3可知，影响EPP得率的顺序依次为：提取温度（C）＞提取时间（D）＞料液比（B）＞超声功率（A），且提取EPP的最佳工艺是A3B2C3D2，即提取温度50 ℃，提取时间50 min，料液比1:50 g/mL，超声功率540 W。

表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

进行了3次正交试验结果验证试验，测的EPP得率为43.21%，确认提取工艺最优参数为A3B2C3D2。

2.3 EPP对α-葡萄糖苷酶活性的影响

α-葡萄糖苷酶是关键的消化酶，抑制α-葡萄糖苷酶可降低消化率从而缓解餐后血糖。对于Ⅱ型糖尿病的治疗，可以利用抑制α-葡萄糖苷酶的活性从而抑制血糖水平的异常升高[20-22]。如图2所示，不同浓度的EPP对α-葡萄糖苷酶均有抑制作用，EPP浓度在0.2～1 mg/mL时，抑制率与EPP浓度呈正相关，1 mg/mL EPP抑制率为45.46%。而常国立等[23]研究发现1 mg/mL杨梅核多酚对α-葡萄糖苷酶的抑制率高于90%且效果优于同浓度阿卡波糖的抑制率，可能是由于提取的EPP未进行纯化，导致相同浓度时，EPP的抑制效果较差。

图2 EPP对α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.2 Inhibition rate of α-glucosidase by EPP

2.4 EPP对糖尿病小鼠体重的影响

糖尿病小鼠体重通常会出现缓慢增长甚至降低的状态。由表4可知，试验前后，空白组小鼠的体重与其他试验组均存在极显著差异（P＜0.01），表明建立糖尿病小鼠模型成功；阳性对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组给药后体重均有所上升，但与模型组相比，均无统计学差异（P＞0.05）；EPP三个剂量组之间及与阳性对照组也均无显著差异（P＞0.05）。

表4 EPP对糖尿病小鼠体重的影响（g）Table 4 Effects of EPP on body weight of hyperglycemic mice (g)

2.5 EPP对糖尿病小鼠空腹血糖的影响

空腹血糖值可以反映出机体血糖代谢的状况[24]。由图3可知，试验前，与空白组相比，糖尿病小鼠空腹血糖值均升高，具有极显著差异（P＜0.01），且注射四氧嘧啶的小鼠各组间空腹血糖值无显著差异（P＞0.05），表明糖尿病小鼠建模成功。经4周灌胃后，与空白组相比，模型组和低、中、高剂量组血糖值均升高，存在极显著差异（P＜0.01）；虽然低剂量组血糖值降低，但与模型组无显著性差异（P＞0.05），中剂量组存在显著差异（P＜0.05），阳性药组及高剂量组血糖值明显下降，存在极显著差异（P＜0.01）；与阳性药组相比，EPP干预的剂量组均存在极显著的差异（P＜0.01），但血糖值均高于阳性药组，表明EPP对降低空腹血糖水平有积极作用，但效果不及阿卡波糖治疗效果，这可能是由于注射四氧嘧啶对小鼠胰岛细胞造成了不可逆的损伤，EPP的干预仅能改善空腹血糖水平，而不能使其恢复至正常状态[25]。

图3 EPP对糖尿病小鼠空腹血糖的影响Fig.3 Effects of EPP on fasting blood glucose in hyperglycemic mice

由血糖下降率可知，模型组、阳性药组和EPP干预的三个剂量组血糖下降率均高于空白组，且存在极显著差异（P＜0.01）；阳性药和EPP干预均使之呈现出较高的血糖下降率，与模型组比，低剂量组存在显著差异（P＜0.05），阳性药组和中、高剂量组存在极显著差异（P＜0.01）；EPP干预的三个剂量组血糖下降率均低于阳性药物组，存在极显著的差异（P＜0.01），结论与空腹血糖值相同，且高剂量的EPP干对糖尿病小鼠的空腹血糖值预有更好的治疗效果。

2.6 EPP对小鼠糖耐量的影响

糖耐量可反映出机体对葡萄糖代谢的调节能力。由图4可知，给药0.5 h时，除空白组外，所有小鼠的血糖值均达到最高水平；与阳性药组相比，高剂量组0.5 h血糖值明显降低，具有显著差异（P＜0.05）。给药2 h后，灌胃葡萄糖溶液引起的血糖值波动基本消失；除空白组外其他实验组血糖值仍较高，且与空白组相比存在极显著差异（P＜0.01）；经低、中剂量EPP灌胃小鼠的血糖值与模型组相比无显著差异（P＞0.05），但经高剂量EPP灌胃小鼠的血糖值与模型组相比存在显著差异（P＜0.05）；与阳性药物组相比，低、中、高剂量组血糖值降低效果较差，低剂量组存在极显著差异（P＜0.01），中剂量组存在显著差异（P＜0.05），且经过EPP干预（如图5），血糖曲线下面积极显著降低（P＜0.01）。上述结论表明EPP的降血糖作用具有剂量依赖性，EPP能有效提升糖尿病小鼠的糖耐量，EPP可以改善糖尿病小鼠，降低小鼠机体葡萄糖的负荷，促进代谢，有效降低血糖值，与赵艳威等[8]研究结果一致。

图4 EPP对糖尿病小鼠糖耐量的影响Fig.4 Effects of EPP on glucose tolerance in hyperglycemic mice

图5 EPP对糖尿病小鼠血糖曲线下面积的影响Fig.5 Effects of EPP on area under the blood glucose curve in hyperglycemic mice

3 结论

本研究对紫黑色茄皮以蒸馏水为提取剂进行超声辅助提取，研究优化了EPP的提取工艺：最优超声功率为540 W，料液比为1:50 g/mL、提取温度为50 ℃、提取时间为50 min，此条件下EPP的得率为43.21%。通过对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率确定EPP具有体外降血糖功效，1 mg/mL的EPP在体外对α-葡萄糖苷酶抑制率为45.46%。利用EPP对糖尿病小鼠进行干预治疗，通过测定小鼠的体重、空腹血糖值及糖耐量，确定了EPP不会使正常小鼠的血糖代谢异常；对糖尿病小鼠具有明显的降血糖作用，且高剂量EPP具有更优的降血糖效果。这表明EPP具有治疗Ⅱ型糖尿病的潜力，且不会对正常的胰腺组织产生负面影响。但EPP的具体成分需进行进一步研究。本研究可提升茄皮的综合利用价值，为降血糖相关产品的开发提供新的研究思路。