双菌发酵对祛湿汤理化特性及风味的影响

陈 扬，梁泓波，李雅琪，王 琨，黎 攀，杜 冰

（华南农业大学食品学院，广东广州 510642）

三仁汤、赤小豆薏仁汤、参苓白术散等均是有名的祛湿方剂，具有健脾祛湿的功效[1-3]。其中，茯苓、白扁豆、薏米、杏仁、甘草均是具有祛湿作用的药食同源材料，含有丰富的多糖[4]、黄酮[5]、蛋白[6]等成分。人们常常利用药食同源材料制成汤以达到祛湿的目的，但清水煎制的祛湿汤存在营养价值不高和风味口感不佳[7]的问题。而对如何进一步提升祛湿汤的营养价值和风味口感的研究尚未见到。

发酵是借助酶与微生物的作用，在一定的环境条件下使食品通过发酵过程，改变其性能或是增强其功效的炮制方法。已有研究表明，益生菌发酵可以提高药食同源材料中营养成分的含量，增强药食同源材料的功效[8]。而单一菌种发酵产生的食品风味单一，混菌发酵能更好地增加风味[9]。目前有部分研究已公开了关于复合菌种发酵食品的报告，国内研究如周映君等[10]利用酵母菌与植物乳杆菌复合发酵了新会柑并提升了其的营养成分；吴珊珊等[11]利用酵母菌和乳酸芽孢杆菌研究开发了佛手果酒并优化了其工艺，提升了其风味。国外研究如Ogodo等[12]利用乳酸菌复合菌发酵了玉米粉以提高玉米粉的营养因子含量。由此可以推测：复合菌种发酵可能会提升祛湿汤的营养价值和风味口感。乳酸芽孢杆菌（Bacillussp.）DU-106是一种从传统发酵奶酪中筛选出来的益生菌，有着耐酸和产酸能力强的特点，目前在发酵食品行业，特别是发酵药食同源食品中有着广泛的应用，对提高药食同源材料的功能特性有着良好的作用[13-16]，且已有研究发现，利用乳酸芽孢杆菌对药食同源材料进行接种发酵可以提高其活性成分[17]；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）是具有耐酸和发酵低聚果糖能力的益生菌[18]，其发酵生成物以乳酸为主[19]，有利于发酵后生成提高发酵物酸度。而利用乳酸芽孢杆菌DU-106以及植物乳杆菌复配发酵药食同源材料水煎剂的研究尚未见到。因此，这两种益生菌作为具有潜力的菌群，可共同运用于祛湿汤的发酵中。

鉴于此，本研究将采用乳酸芽孢杆菌DU-106与植物乳杆菌复配发酵的方式对茯苓、白扁豆、薏米、杏仁、甘草制成的祛湿汤进行发酵，并对其发酵前后的理化指标、风味物质和感官变化差异进行探究，以期为风味独特、营养丰富、功效良好的新型祛湿饮料提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

茯苓、白扁豆、薏米、杏仁、甘草 广州仲正中药饮片有限公司；乳酸芽孢杆菌（Bacillussp.）DU-106和植物乳杆菌，菌粉浓度为1×1012CFU/g 由华南农业大学新资源与功能性原料研究及评价中心鉴定及保藏；白砂糖 南字牌食品旗舰店；CuSO4·5H2O、C16H18ClN3S·3H2O、C4H4O6KNa·4H2O、NaOH、(CH3COO)2Zn、C2H4O2、K4Fe(CN)6·3H2O、Al(NO3)3、KOH、苯酚、醋酸铜结晶、酒石酸钾钠、碘化钾、牛血清白蛋白、柠檬酸钠、没食子酸标准品等 均为分析纯，广州化学试剂厂；5% NaNO2标准溶液 上海麦克林生化科技有限公司。

PHS-3E型pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；UV-1100型紫外分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；DHP600型电热恒温培养箱 北京市永光明医疗仪器厂；L-8900型全自动氨基酸分析仪

日本日立公司；QP2010 Ultra型气相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 祛湿汤的制备 将茯苓、白扁豆、薏米、杏仁、甘草分别洗净后烘干，准确称取茯苓20.0 g、白扁豆20.0 g、薏米20.0 g、杏仁8.0 g、甘草5.0 g，注入1200 mL纯净水，煮40 min；煮后装于发酵罐中，封口，115 ℃ 30 min灭菌后，在超净工作台向发酵罐中添加3%（w/w）白砂糖；将0.1 g乳酸芽孢杆菌DU-106和植物乳杆菌的混合菌粉添加到100 mL生理盐水中，活化30 min后，向发酵罐中添加3.3%菌种活化液质量的活化液，于28 ℃下密封发酵7 d。每日在超净工作台取样于无菌离心管中，于-20 ℃冰箱中冻存。

1.2.2 pH、总酸与还原糖的测定 使用pH计对祛湿汤直接测定。祛湿汤总酸参照GB/T 12456-2008《食品中总酸的测定》[20]进行测定，折算系数以乳酸0.090计。祛湿汤还原糖参照GB 5009.7-2016《食品中还原糖的测定》[21]进行测定。

1.2.3 生物活性成分的测定

1.2.3.1 总多糖的测定 总多糖参照刘培等[22]的方法，采用苯酚硫酸法进行测定。精密吸取发酵0～7 d的祛湿汤0.8 mL于具塞试管，加水补至1 mL，加入5%苯酚1 mL后迅速加入浓硫酸5 mL，摇匀，降至室温后，置于沸水浴中加热15 min，再置于冷水浴中降至室温，随行作空白对照，于490 nm处测吸光度。精密吸取D-葡萄糖对照品溶液0.15、0.30、0.45、0.60、0.75、0.90、1.00 mL，置于具塞试管中，精密吸取供试品溶液0.8 mL于具塞试管，加水至1 mL，后同上述法测定吸光度。每根试管做3个平行试验，绘制标准曲线，计算得到标准曲线方程：y=5.0771x+0.0418 （R2=0.9991）。

1.2.3.2 总蛋白的测定 总蛋白参照周艳星等[23]的方法并稍作修改，采用双缩脲试剂法进行测定。分别准确吸取1 mL发酵0～7 d的祛湿汤放入试管中，再依次加入4 mL双缩脲溶液，摇匀，在室温下反应30 min。空白溶液作为参照物，在波长540 nm处测各管吸光度。在试管中分别精准吸取牛血清白蛋白标准品溶液0、0.2、0.6、0.8、1.0 mL的标准蛋白质溶液，用水补足到1 mL，后同上述法测定吸光度。每根试管做3个平行试验，绘制标准曲线，计算得到标准曲线方程：y=0.3133x+0.0785 （R2=0.9991）。

1.2.3.3 总多酚的测定 多酚参照李娜等[24]的方法并稍作修改，采用福林酚法，以没食子酸作为对照品进行测定。取1 mL发酵0～7 d的祛湿汤于试管中，分别加入1 mL福林酚显色剂及3 mL 20% Na2CO3溶液，混匀后于50 ℃水浴中反应30 min。在765 nm波长下测定吸光度。准确称取质量浓度为1000 mg/L的没食子酸标准储备液0、1.25、2.5、5、10、20、40 mL于100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，配制成质量浓度为0、12.5、25、50、100、200和400 mg/L的系列标准溶液，分别取1 mL于试管中，后同上述法测定吸光度。每根试管做3个平行试验，绘制标准曲线，计算得到没食子酸标准曲线方程：

y=0.0055x+0.0842 （R2=0.9995）。

1.2.3.4 总黄酮的测定 黄酮参照李娜等[24]的方法并稍作修改，采用AlCl3比色法，以芦丁作为对照品进行测定。取1 mL发酵0～7 d的祛湿汤置于25 mL容量瓶中，加70%乙醇至6 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀后放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀后再次放置6 min，加4%氢氧化钠溶液10 mL，加70%乙醇至刻度，摇匀后放置15 min，以不加样品的空白制剂按上述操作得到空白溶液，在510 nm处测定溶液吸光度。精密量取1 g/L的对照品溶液0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5 mL分别置于25 mL容量瓶中，按上述测量方法进行测定。每根试管做3个平行试验，绘制标准曲线，计算得到芦丁标准曲线方程：y=1.442x-0.022 （R2=0.9998）。

1.2.4 氨基酸组成的测定 参考GB 5009.124-2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》[25]并稍做修改，准确量取发酵第0～7 d样品各5 mL分别倒入水解管中，加入5 mL 12 mol/L的盐酸溶液，将水解管放入冷冻剂中冷冻5 min，充入氮气，拧紧瓶盖，放入110 ℃的电热鼓风恒温箱中水解23 h，再用滤纸过滤水解液，取1 mL过滤好的水解液置于烧杯中，60 ℃水浴蒸干，再加入1 mL一级水，再次蒸干，重复两次。彻底蒸干后加入4 mL pH2.2的柠檬酸钠缓冲溶液，振荡混匀，吸取溶液通过0.22 μm滤膜后，转移至仪器进样瓶，注入氨基酸自动分析仪分析。检测条件：色谱柱为阳离子树脂柱LCAK06/Na；流动相为柠檬酸钠A（pH3.45）与柠檬酸钠B（pH10.85）；洗脱泵流速0.45 mL/min，衍生泵流速0.25 mL/min；检测波长：570与440 nm；检测温度：58～74 ℃梯度升温。

1.2.5 有机酸含量的测定 祛湿汤的有机酸参考GB/T 40179-2021[26]中测定有机酸的方法进行测定，色谱条件：Amnex HPX-87H色谱柱；流动相为0.1%磷酸水溶液；流速400 μL/min；柱温40 ℃；紫外检测器波长210 nm；手动进样量20 μL。根据保留时间及峰面积分别定性及定量，对照标准曲线方程计算出物质含量。

1.2.6 挥发性风味物质的测定 祛湿汤的挥发性风味物质测定参照李婷婷等[27]的方法稍作修改后进行测定。分别称取发酵第0～7 d样品各5 g置于50 mL的顶空瓶中，锡箔纸密封，60 ℃水浴平衡5 min 后将65 μm DVB/CAR/PDMS萃取头插入顶空瓶中吸附30 min，萃取后将纤维头插入气相色谱系统解吸3 min，解吸温度为250 ℃。

GC条件：毛细管柱为HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度240 ℃；进样量2 μL；分流比5:1；溶剂延迟时间3.8 min；升温程序：初始柱温40 ℃，保持3 min后，以3 ℃/min升至230 ℃，保持2 min；载气（He）流速1.88 mL/min。

MS条件：电子轰击（EI）离子源；离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃；质谱接口温度250 ℃；离子化方式EI；电子能量70 eV；质量扫描范围（m/z 29～500）。

将质谱数据经计算机在NIST 14谱库检索，结合手动检索校对，选取匹配度大于800（最大值为1000）成分作为定性结果。

1.2.7 感官评定 感官评价小组由20名（男10名，女10名）通过感官分析培训的食品专业人员组成，分别从色泽、香气、滋味和外观澄清度方面对发酵第0、3、5及7 d的发酵祛湿汤进行感官评定，详细的感官评分标准如表1所示[28]。

表1 发酵祛湿汤感官评定标准Table 1 Sensory evaluation of fermented Qushi decoction

1.3 数据处理

采用单因素方差分析的方法，运用SPSS 25.0软件进行显著性分析，P＜0.05表示差异显著；采用Microsoft Office Excel 2010与GraphPad Prism 5.0软件进行绘图分析。所有实验重复三次，实验结果以平均值±标准误差（mean±SD）的方式表示。

2 结果与分析

2.1 祛湿汤发酵过程中pH和总酸的变化

pH和总酸与祛湿汤的品质密切相关，是祛湿汤发酵过程中重要的理化指标。祛湿汤发酵过程中pH和总酸的变化如图1和图2所示。由图1可知，祛湿汤的pH随时间的延长而降低，在发酵前期pH迅速下降，在发酵4 d后降到3以下，后趋于稳定。这是因为在发酵前期乳酸菌大量产酸，导致初期pH迅速下降；到达发酵后期，低pH环境影响了菌种的生长，pH进入稳定期[28]，发酵前期与后期的pH具有显著性差异（P＜0.05）。由图2可知，祛湿汤的总酸随时间的延长而升高，并在第7 d达到峰值11 g/kg，表明祛湿汤的pH与总酸含量与发酵时间有密切联系。对比张平等[29]使用植物乳杆菌发酵梨汁的研究，其pH最终未下降到3以下，而DU-106与植物乳杆菌复配发酵后产酸更多，在发酵后期pH更低。

图1 发酵过程中pH随时间的变化Fig.1 pH changes with time during fermentation

图2 发酵过程中总酸随时间的变化Fig.2 Changes of total acid over time during fermentation

2.2 祛湿汤发酵过程中还原糖的变化

还原糖的变化也与祛湿汤的品质相关，也是祛湿汤发酵过程中的一个重要的理化指标。祛湿汤发酵过程中还原糖的变化如图3所示。由图3可知，祛湿汤的还原糖含量随时间的延长而降低，发酵初期还原糖含量迅速降低，这是因为在发酵前期，乳酸菌消耗还原糖；在发酵4 d后趋向稳定。这表明乳酸菌需要消耗还原糖来产酸，祛湿汤中还原糖的含量会影响产酸量。

图3 发酵过程中还原糖随时间的变化Fig.3 Changes of reducing sugar over time during fermentation

2.3 祛湿汤发酵前后生物活性成分的变化

2.3.1 祛湿汤发酵前后多糖的变化 多糖具有免疫调节、抗衰老、降血脂、抗病毒、抗炎等多种药理作用，是祛湿汤中重要的一个活性成分。有研究表明，益生菌可以通过分解培养基中的有机物质，提高发酵后多糖的含量[30]。通过对祛湿汤发酵过程中的总多糖含量的测定发现，发酵第0～7 d的多糖含量分别为19.08、19.08、19.14、19.61、20.14、20.53、20.80、20.95 mg/mL，多糖含量在发酵过程中显著提高（P＜0.05），见图4。这与何彩文等[31]利用酵母粉发酵茯苓以提高茯苓多糖含量的研究结果一致。

图4 发酵过程中多糖随时间的变化Fig.4 Changes of polysaccharides over time during fermentation

2.3.2 祛湿汤发酵前后蛋白的变化 在药食同源中药中，存在着生物大分子蛋白质，其种类丰富，功能各异，已被证明有抗肿瘤、抗炎、免疫调节等作用[32]。Yin等的研究表明，微生物可以通过利用薏米中纤维素或是半纤维素酶解后生成的可溶性糖，从而提高蛋白质的含量[33]，而薏米蛋白有较好的健脾祛湿的功能[34]。通过对祛湿汤发酵过程中的蛋白含量的测定发现，发酵第0～7 d的蛋白含量分别为0.90、0.91、0.97、1.14、1.39、1.47、1.58、1.66 mg/mL，蛋白含量在发酵过程中显著提高（P＜0.05），见图5。对比Yin等[33]的研究中，发酵薏米的蛋白含量并未得到提升，双菌发酵祛湿汤更具优势。

图5 发酵过程中蛋白随时间的变化Fig.5 Changes in protein over time during fermentation

2.3.3 祛湿汤发酵前后多酚的变化 天然中草药中广泛存在着多酚化合物，其具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗肿瘤等活性[35]。通过测定祛湿汤发酵过程中的多酚含量发现，发酵第0～7 d的多酚含量分别为

32.68、32.72、32.75、37.81、43.20、46.25、49.80、52.45 μg/mL，多酚含量在发酵过程中得到显著性提升（P＜0.05），见图6。有研究表明，乳酸菌能够将植物细胞中的活性物质，转化成为其代谢产物并产生新的酚类化合物，且多酚含量越高，其潜在生物学功效越强[36]。

图6 发酵过程中多酚随时间的变化Fig.6 Changes in polyphenols over time during fermentation

2.3.4 祛湿汤发酵前后黄酮的变化 黄酮类化合物是一种很强的抗氧化剂，可有效清除体内的氧自由基, 具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎等生物活性[37]。通过对祛湿汤发酵过程中的黄酮含量的测定发现，发酵第0～7 d的黄酮含量分别为45.79、45.84、46.17、46.42、49.10、50.53、52.44、53.26 μg/mL，黄酮含量在发酵过程中显著提升（P＜0.05），见图7。这可能是微生物发酵促使祛湿汤中酶的活力增加，从而合成新的黄酮类化合物[38]。有研究表明，黄酮含量越高，其功效越强[39]。对比易桥宾等[40]的研究，自然发酵可可豆后其多酚与黄酮含量未得到提升，双菌发酵祛湿汤可以显著提升祛湿汤中多酚与黄酮的含量（P＜0.05），更具优势。由此可以猜测，DU-106与植物乳杆菌复配发酵可以通过酶降解的作用，有效利用药食同源材料中的有机物质增加祛湿汤中多糖、蛋白、多酚和黄

图7 发酵过程中黄酮随时间的变化Fig.7 Changes in flavonoids over time during fermentation

酮的含量，从而提高祛湿汤的功效。

2.4 祛湿汤发酵前后水解氨基酸的变化

由表2可知，发酵第0～7 d的祛湿汤均含有18种氨基酸；各个样品均含有7种人体必需氨基酸（Essential amino acid，EAA）（色氨酸未检测），总氨基酸含量（Total amino acids, TAA）随发酵时间的增加而增加，在发酵第7 d祛湿汤的EAA和NEAA含量都得到显著提升（P＜0.05），EAA含量最高为65.00 mg/100 g，TAA达到最大值为429.00 mg/100 g。有研究表明，F值越大说明蛋白质潜在的生物活性可能越好[41]。由表2可知，乳酸菌发酵后F值提高了，说明发酵可以提高祛湿汤的潜在生物活性功能。

表2 发酵祛湿汤的氨基酸含量Table 2 Amino acid content of fermented Qushi decoction

2.5 祛湿汤发酵前后有机酸的变化

由2.1可知，祛湿汤总酸含量随发酵时间的增加而上升，这是因为乳酸菌在不断地产酸。通过对祛湿汤发酵前后的乳酸含量的测定得出，发酵第0 d的乳酸含量为0.02 mg/g，发酵第7 d的乳酸含量显著提升（P＜0.05），达到最大值为6.83 mg/g。由表3可知，对比其他有机酸，乳酸含量增加幅度最大。证明乳酸含量的增加是总酸含量增加的关键因素。

表3 祛湿汤中五种有机酸的标准曲线方程以及发酵前后含量变化Table 3 Standard curve equation of five organic acids in Qushi decoction and the changes of their contents before and after fermentation

2.6 祛湿汤发酵前后挥发性风味物质变化分析

挥发性香气是发酵食品重要的品质之一，很大程度上会影响消费者接受程度和偏好[42]。采用顶空固相微萃取-气质联用技术对第0～7 d的发酵祛湿汤进行分析，如表4所示，共测得65种挥发性物质，其中包括烯类9种，醇类18种，酯类6种，酮类10种，醛类18种和其他物质4种。发酵第0～7 d的祛湿汤分别检测出香气物质25、22、21、31、21、27、30和31种，前2 d正己醛、辛醇的相对含量较高，呈花果香气；后6 d苯甲醛的相对含量均为最高，分别为25.83%、53.72%、60.16%、60.40%、67.82%和64.75%；苯甲醛具有杏仁香气，是杏仁原料本身的特征香气。

表4 祛湿汤发酵前后的挥发性物质Table 4 Volatile compounds of Qushi decoction before and after fermentation

对于发酵的祛湿汤来说，虽然醛类、酯类以及醇类等物质不是含量最高的物质，但是由于它们的阈值较低，它们对发酵祛湿汤香气也有重要的贡献。在发酵0 d组中，含量比较高的是醛类；接种乳酸菌后，由于乳酸菌进行乳糖、氨基酸等的物质代谢时，可使得相应的醛类物质通过脱氢酶还原形成某些醇[43]；经过乳酸菌发酵后，大量的酸被产生，酸与醇类物质发生酯化反应生成酯类物质，因此酯类和醇类物质种类和含量得到提升，丰富了祛湿汤的风味。

续表 4

续表 4

2.7 发酵前后祛湿汤的感官评价

感官品质是食品是否可以获得消费者认可的关键指标。发酵第0、3、5和7 d的祛湿汤感官评定结果如表5所示。从色泽上看，各组发酵祛湿汤色泽均匀，颜色微微发黄。在其气味上，发酵第0 d组无发酵香气，发酵时间越长，发酵香气越浓，各组均无其他异味，差异较为明显。从滋味来看，发酵第0 d组无发酵酸味、滋味较为单一；第3 d组与第5 d组酸度不够浓郁；发酵第7 d组滋味协调、酸甜适中。从外观澄清度上看，每组得分差别不大，均无大量沉淀。综合得分高低为：发酵第7 d组＞发酵第5 d组＞发酵第3 d组＞发酵第0 d组。发酵第7 d组是4个发酵组中感官品质最好的；发酵0 d组的气味、滋味较其他组差。复合菌发酵在一定程度上改善了祛湿汤的香气与滋味，使得香气具有独特的发酵风味，更受人们喜爱。

表5 发酵祛湿汤的感官评价Table 5 Sensory evaluation of fermented Qushi decoction

3 结论

本试验探究了乳酸芽孢杆菌DU-106与植物乳杆菌复配发酵对祛湿汤理化性质和风味口感的影响。结果表明：发酵过程中，乳酸芽孢杆菌DU-106和植物乳杆菌发酵能通过消耗还原糖来显著降低pH、提高总酸含量，最高可达11.00 g/kg。多糖、蛋白质、多酚、黄酮等活性成分的含量也随发酵时间的增加而提高，且在发酵第7 d达到最大含量，含量分别为20.95、1.66 mg/mL、52.45、53.26 μg/mL。总氨基酸含量、必需氨基酸含量和F值也随发酵时间的增加而增加，且在发酵第7 d达到最大值为429 mg/100 g，必需氨基酸含量最高为65 mg/100 g。有机酸特别是乳酸在发酵后含量大大增加，含量最高达到6.83 mg/g。由此可猜测，发酵可以通过提高祛湿汤中的活性成分种类及含量，从而提升祛湿汤的功效及营养价值。益生菌发酵后能显著改变祛湿汤香气成分，增加酯类和醇类物质的种类及相对含量，使得祛湿汤获得特殊的发酵香气。发酵后的祛湿汤在活性成分含量及风味方面都比发酵前组有所提升。

因此，双菌发酵有利于从多个方面提升祛湿汤的品质，解决祛湿汤营养价值不高和风味口感不好的问题。发酵后祛湿汤的功效评价仍需进一步探索。本研究为发酵技术提高祛湿汤功效或是药食同源材料祛湿产品开发提供了前期的基础和理论依据。