红白忍冬花青素合酶编码基因rLjANS1的克隆、表达分析及其与花色苷积累的关系

谭政委， 鲁丹丹， 李 磊， 余永亮， 许兰杰， 董 薇， 杨红旗， 杨 青， 李春明， 安素妨， 梁慧珍

(河南省农业科学院芝麻研究中心，河南郑州 450002)

金银花为大宗中药材，来源于忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的花蕾或待初开的花。金银花中含有丰富的挥发油、黄酮类、有机酸类、三萜类和环烯醚萜类等化学成分，因其具有抗菌消炎、抗病毒、抗肿瘤、抗衰老等功效，具有重要的临床药用价值[1]。此外，金银花属于中华人民共和国国家卫生健康委员会公布的110种药食同源名录品种之一，其提取物已被广泛应用于香料、化妆品、食品饮料等领域[2]。

红白忍冬[LonicerajaponicaThunb. var.chinensis(Wats.) Bak.]是一个忍冬自然变异的自变种，其幼枝呈紫黑色，幼叶带紫红色，花冠外面呈紫红色，里面呈白色。与忍冬相比，红白忍冬中绿原酸、花色苷(anthocycanins)含量较高且挥发油种类更多[3]，香味更加浓郁，并且具有更强的抗寒性、耐旱性，花期长且开花时间比忍冬早，四季长青，因此也具有较高的观赏价值和茶饮价值。

花色苷是一类天然水溶性色素，广泛存在于植物的花、根、茎、叶及果实等多种组织中，使这些组织呈现红色、蓝色或粉色。花色苷在植物的生长发育和抗逆反应中都起着重要作用，主要包括抗氧化、抗紫外胁迫及吸引昆虫与食草动物前来传播花粉和种子等[4]。此外，花色苷还具有抗炎、抗肿瘤、调节血脂等生物活性[5-6]，因此可见，作为一种天然存在的色素，花色苷在应用到食品添加剂方面具有良好的前景[7]。花青素的生物合成涉及许多类黄酮生物合成的必需结构基因，包括苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase，PAL)、肉桂酸-4-羟化酶(cinnamate-4-hydroxylase，C4H)、4-香豆酸：辅酶A连接酶(4-coumarate：coenzyme A ligase，4CL)、查尔酮合酶(chalcone synthase，CHS)、查尔酮异构酶(chalcone isomerase，CHI)、黄烷酮-3-羟化酶(flavanone-3-hydroxylase，F3H)、二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase，DFR)、花青素合成酶[(anthocyanin synthase(ANS)，又称leucoanthocyanidin dioxygenase(LDOX)]及UDP类黄酮葡萄糖基转移酶(UDP flavonoid glucosyltransferase，UFGT)[8]。

ANS作为花色苷合成途径中重要的关键酶之一，已从拟南芥[9]、草莓[10]、红薯[11]、可可树[12]、百脉根[13]等多种植物中得到克隆，ANS的功能特性及表达量影响了植物花色苷的种类和含量，如龙胆花中ANS基因突变可导致花色变白[14]，金钟连翘中ANS的表达量决定了花青素含量[15]。Yuan等研究发现，红白忍冬中的花色苷以矢车菊素-3，5-二葡萄糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷为主，并且DFR基因结构变异是导致忍冬中花色苷含量较低的重要因素之一[3]，但是目前关于ANS基因表达量是否与红白忍冬花色苷含量有关的研究未见报道。为了探究ANS基因在红白忍冬花色苷合成中的作用，本研究以红白忍冬为材料，通过转录组数据分析、RT-PCR 方法等，从红白忍冬中克隆得到rLjANS1基因cDNA序列全长，随后对该基因进行生物信息学分析，用qRT-PCR对其表达模式进行分析，并对其表达量与花色苷含量进行相关性分析，以期为红白忍冬花色苷生物合成和rLjANS1基因功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所用红白忍冬于2017年种植于河南农业科学院现代农业研究开发基地，经河南省农业科学院芝麻研究中心梁慧珍研究员鉴定为忍冬的变种红白忍冬，在自然条件下生长。于2021年4—5月在河南农业科学院现代农业研究开发基地采取其根、茎、叶和不同发育时期的花，红白忍冬花发育时期参照忍冬花期划分标准，分为幼蕾期、三青期、二白期、大白期、银花期、金花期。每份样品设置3个生物学重复，每个生物学重复分成2份，分别用于基因、花色苷的定量分析，先将样品在液氮中速冻，然后转移至超低温冰箱中保存备用。

1.2 主要试剂

总RNA提取所用Quick RNA Isolation Kit试剂盒购自北京华越洋生物科技有限公司，反转录试剂盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)、pMD19-T和荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa TB Green®Premix ExTaqTMⅡ)均购自宝生物工程(大连)有限公司，KOD FX购自东洋纺(上海)生物科技有限公司，DNA凝胶回收试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司，EscherichiacoliDH5α感受态细胞由河南省农业科学院芝麻研究中心保存，引物合成和基因测序委托河南尚亚生物技术有限公司完成。

1.3 方法

1.3.1 总RNA的提取及cDNA第1链的合成 按照北京华越洋生物科技有限公司的试剂盒说明书提取样品的总RNA，用1.2%琼脂糖凝胶电泳对提取的总RNA的质量和完整性进行检测，用NanoDrop 2000分光光度计对总RNA进行定量，参照试剂盒说明书将总RNA反转录为第1链cDNA。

1.3.2rLjANS1基因cDNA全长序列的克隆 根据笔者所在研究室构建的红白忍冬转录组数据库注释信息，筛选注释为“leucoanthocyanidin dioxygenase/anthocyanidin synthase”并有完整读码框的转录本，提取转录本的核酸序列，用Primer Premier 5软件目的基因引物，上游引物序列为5′-A T G G T G A C C A C G A T G T C C T C A A G-3′，下游引物序列为5′-T C A T T T C T T C T C A A G A G C T T C T T-3′。以提取得到的不同花期的cDNA为模板，用KOD酶进行PCR扩增，得到基因全长cDNA序列，PCR反应程序：95 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，68 ℃ 60 s，30 个循环；68 ℃ 10 min。反应结束后，对PCR产物进行电泳并切取目的片段，回收后与pMD19-T载体连接，并用连接后的载体转化DH5α感受态细胞，通过PCR筛选阳性克隆，将菌液送往河南尚亚生物技术公司测序。

1.3.3 rLjANS1蛋白的生物信息学分析 rLjANS1蛋白的氨基酸组成、分子量、理论等电点及稳定性参数的分析通过在线软件ProtParam (https：//web.expasy.org/protparam/)完成；通过美国国家生物信息中心(NCBI)在线查找软件ORF finder查找rLjANS1的开放阅读框(ORF)；通过NCBI的CD-Search(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)对rLjANS1蛋白的保守结构域进行预测分析；使用在线工具SOPMA (https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html)对rLjANS1蛋白的二级结构进行预测分析；通过SWISSMODLE (https：//swissmodel.expasy.org/interactive)完成rLjANS1蛋白的三级结构分析；分别用SignalP-5.0在线软件 (https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0)和PSORT (https：//www.genscript.com/psort.html)完成信号肽的预测和亚细胞定位分析；用DNAMAN 6.0软件对rLjANS1蛋白及其同源蛋白的氨基酸序列进行多重比对；通过MEGA 7.0软件中的Neighbor-Joining构建rLjANS1蛋白的系统进化树，并通过Bootstrap方法对进化树进行检测，Bootstrap值设置为100。

1.3.4rLjANS1基因的表达模式分析 通过荧光定量PCR技术检测rLjANS1基因在不同组织部位及不同发育时期花中的表达量，用Premier5设计rLjANS1基因的荧光定量PCR引物，上游引物序列为5′-C C C T C A A C T G C C A A C A A T-3′，下游引物序列为5′-A T C A C C C C C C A C T C C A T-3′；内标参比基因为Ct60S基因，上游引物序列为5′-C A T C C A T T A T C C A A C A A T C-3′，下游引物序列为5′-A A G A G T A A T C A G T C T C C A-3′。反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，40个循环。通过熔解曲线分析目的基因PCR扩增的特异性，反应程序：从55 ℃到 94 ℃，升温速度为0.1 ℃/s。每个荧光定量PCR反应重复3次，采用2-ΔΔCT相对定量法对基因进行表达水平的分析。

1.3.5 花色苷含量的测定及相关性分析 用Wrolstad等的pH示差法对花色苷含量进行定量分析[16]，称取0.5 g用液氮研磨的样品，加入5 mL提取液，混匀后于4 ℃避光保存过夜，4 ℃ 8 000 r/min离心10 min，取上清液，分别检测样品在pH值为1.0、4.5时520、700 nm处的吸光度，用如下公式计算花色苷含量：花色苷含量(μg/g)=(D/εL)×Mm×DF×V/m×1 000。式中：D=(D520 nm-D700 nm)pH1.0-(D520 nm-D700 nm)pH4.5；ε为矢车菊-3-葡萄糖苷消光系数(26 900)；L为比色皿光程(1 cm)；Mm为矢车菊-3-葡萄糖苷分子量(449.2)；DF为稀释因子；V为最终体积(mL)；m为样品鲜质量(mg)。用Excel对rLjANS1基因的表达量与其对应样本花色苷含量进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 rLjANS1基因的克隆

笔者所在课题组前期构建了忍冬、红白忍冬S4期的转录组，通过关键词“leucoanthocyanidin dioxygenase/anthocyanidin synthase”和KEGG编号“K05277”对转录组注释文件进行搜索，发现有1条序列Cluster-20471.73376注释为anthocyanidin synthase，并且红白忍冬中FPKM值(354.02±136.65)显著高于忍冬(0.91±0.59)。为了对该基因进行深入研究，笔者根据该注释基因序列设计引物并进行PCR扩增，PCR扩增产物经1%琼脂糖电泳检测。结果如图1所示，目的基因片段长度约 1 100 bp，与预测大小一致。测序结果表明，该基因cDNA序列长1 068 bp，并且测序结果与转录组测序结果一致，具有完整的读码框，编码355个氨基酸(图2)。通过NCBI保守结构域预测分析，发现该基因编码蛋白具有ANS蛋白典型的保守结构域2OG-FeⅡ_Oxy氧化酶结构域(图3)，因此将该基因命名为rLjANS1。

2.2 rLjANS1生物信息学分析

2.2.1 蛋白的理化性状、亚型胞定位、跨膜区域预测 通过Prot Param对rLjANS1蛋白进行分析，其分子式为C1807H2863N475O541S15，包含5 701个原子，相对分子量为40.38 ku，理论等电点为5.47。氨基酸组成及比例的分析结果表明，该蛋白中Glu数量最多，占11.8%，Trp数量最少，占1.4%。带正电荷氨基酸残基、带负电荷氨基酸残基数分别是45、56个，脂肪系数为88.17，亲水性指数为-0.420，不稳定指数为54.85，半衰期为30 h，对以上数据的初步分析发现，rLjANS1蛋白为不稳定的亲水性蛋白。通过PSORT对rLjANS1蛋白的亚细胞定位分析发现，该蛋白定位于细胞质中，用SignalP 5.0对其信号肽进行分析发现，rLjANS1蛋白无信号肽，为非分泌蛋白；用TMHMM 2.0预测发现，该蛋白无跨膜区域，属于非膜蛋白。

2.2.2 rLjANS1蛋白的空间结构分析 用SOPMA对rLjANS1的二级结构进行在线预测，统计结果显示，rLjANS1蛋白的4种主要二级结构主要由无规则卷曲、α-螺旋、延伸链和β-折叠组成，其中无规则卷曲在4种二级结构中所占比例最高，为40.85%，α-螺旋次之，占比为35.21%，延伸链、β-折叠的占比分别为17.75%、6.20%(图4)。用SWISS-MODEL对rLjANS1蛋白进行同源建模，得到rLjANS1蛋白的三维空间模型(图5)。通过ExPAsy structure assessment程序评测推导可知，rLjANS1蛋白模型得分为0.93，可信度较高，与拟南芥中的ANS(PDB：1GP4)的相似度为79.60%。

2.3 rLjANS1蛋白序列比对和进化树分析

通过DNAMAN 7.0软件对rLjANS1蛋白与其他物种的ANS蛋白进行同源性分析，结果表明，该蛋白与蓝果忍冬(Loniceracaerulea，ALU09330.1)、榴莲(Duriozibethinus，XP_022732774.1)、雷公藤(Tripterygiumwilfordii，XP_038687022.1)、三七(Panaxnotoginseng，QKV26469.1)等植物中同源ANS具有较高的同源性，同源性分别为98.31%、86.36%、86.24%、83.94%，并具有植物ANS典型的2OG-FeⅡ_Oxy氧化酶结构域，包含由第236位的组氨酸(His，H)、第238位的天冬氨酸(Asp，D)和第290位的组氨酸组成的亚铁离子结合位点(HxDxnH)及由第300位的精氨酸(Arg，R)、第302位的丝氨酸(Ser，S)构成的2-酮戊二酸特异性结合位点(RxS)(图6)。

将拟南芥、榴莲、草莓、金荞麦、蓝果忍冬、苹果、水稻、垂穗商陆、紫苏、三七、菠菜、蓝猪耳、雷公藤、葡萄、玫瑰、小麦和苜蓿等17种不同物种的ANS蛋白序列与rLjANS1蛋白序列进行比对后构建进化树，结果表明，rLjANS1与同为忍冬科的蓝果忍冬聚为一支，亲缘关系最近，与三七、雷公藤、榴莲、葡萄聚为一个大分支，亲缘关系也较近(图7)，推测这些物种中的ANS可能具有相似功能。

2.4 rLjANS1基因表达模式的分析

用qRT-PCR对红白忍冬根、茎、叶及不同发育时期花组织(S1～S6)中rLjANS基因的表达情况进行定量分析，结果表明，rLjANS1基因除了不在根中表达外，在其他所测组织中都有表达，在叶中的相对表达量最高；另外，在不同花发育时期，rLjANS1基因的相对表达量都呈现先升高后下降的趋势，其中在S4期的相对表达量最高(图8)。

2.5 rLjANS1基因表达与花色苷含量的相关性分析

红白忍冬不同组织部位及不同花发育时期的花色苷含量如图9所示。从检测结果看，在红白忍冬根中几乎检测不到花色苷，红白忍冬地上部分组织中都有花色苷积累，其中叶中的花色苷含量最高。随着花发育进程的推进，花色苷含量呈现先增加后降低的趋势，其中S4期的含量最高。

对rLjANS1基因的相对表达量与其对应样本花色苷含量进行线性回归分析，得出相关系数为0.97(P<0.05)，其相关方程为y=0.008 6x+0.115 8，说明rLjANS基因的表达水平与其对应的花色苷含量呈正相关关系。

3 讨论与结论

花青素合成酶是一个植物花青素生物合成代谢途径中的关键酶，是一个依赖亚铁离子、 2-酮戊二酸的双加氧酶，属于2-氧戊二酸依赖性双加氧酶(2-OGD)超家族，可催化无色花青素(leucoanthocyanidin)转化为有色花色苷元，在植物色泽形成中起着重要作用[14]。ANS最早是从玉米突变体A2中克隆得到的，目前已从金钟连翘(Forsythiaintermedia)、裂叶牵牛(Ipomoeahederacea)、草莓(Fragaria×ananassa)等植物中得到克隆，研究者已对其在色泽形成中的作用进行了相关研究[15，17]。

本研究通过挖掘转录组数据，从红白忍冬中筛选并克隆得到1个ANS基因rLjANS1，编码355个氨基酸，结构域分析表明，rLjANS1蛋白具有ANS蛋白典型的保守结构域2OG-FeⅡ_Oxy氧化酶结构域，属于2-OGD蛋白超家族。生物信息学分析显示，rLjANS1蛋白定位于细胞质，为水溶性蛋白，这与拟南芥、葡萄等物种已报道的ANS一致，也与花青素主要在细胞质中合成的结论[9，18]一致。对rLjANS1进行二级结构预测发现，α-螺旋主要集中在蛋白的前中部和C-末端，与草莓、葡萄的二级结构类似[17-18]。多种序列比对结果显示，rLjANS1与其他已知的ANS蛋白具有较高的同源性，并且从蛋白三级结构的模拟结果看出，rLjANS1与已知结构功能的拟南芥AtANS空间结构非常相似，提示rLjANS1的功能与AtANS具有一定的相似性，这为进一步研究红白忍冬花色形成机制与rLjANS1催化功能提供了很好的借鉴。

黄酮类化合物与其他次生代谢物一样，其积累大多具有组织特性，参与这些代谢物合成的关键基因也具有组织表达特异性，这种特性已被广泛应用于基因组复杂或非模式植物的次生代谢产物合成途径关键基因的分离鉴定中[19-20]。大量研究发现，ANS的表达量与花色苷含量具有一定的相关性。Aharoni等发现，通过RNAi降低草莓ANS基因的表达量，会导致花青素含量降低，花冠也由粉红色变为白色[21]，Nakamura等抑制植物蓝猪耳中ANS基因的表达后，发现植株中花青素含量显著降低[22]。在本研究中，rLjANS1基因在红白忍冬根、茎、叶和不同发育期花组织中的表达量与花青素含量呈明显的正相关，这与百脉根、紫娟茶叶等ANS的研究结果[13，23]一致，表明这些组织中rLjANS1基因的表达可能与红白忍冬花色苷合成和积累密切相关。

目前ANS基因在园艺作物中的研究相对较多，但在红白忍冬中关于该基因表达量与花色苷积累关系的研究较少。本研究在分析转录组数据的基础上，克隆并对该基因的表达量和花色苷含量相关性进行研究，初步证明了rLjANS1基因表达与花色苷的正相关性，为rLjANS基因在红白忍冬中花色苷生物合成积累及遗传改良等方面的相关研究提供了参考。