20份马铃薯品种(系)指纹图谱构建和遗传多样性分析

刘毅强， 田再民， 祁利潘， 龚学臣， 冯 琰， 张云帅， 翟鑫娜， 苏晨晨， 柴国柱， 王 然

(河北北方学院，河北张家口 075000)

马铃薯(SolanumtuberosumL.)属于茄科(Solanaceae)茄属(Solanum)一年生草本植物，是以块茎为食物的粮菜兼用作物。据2017年联合国粮食及农业组织(FAO)统计，中国马铃薯种植面积、产量分别占世界的29.88%、25.56%，是种植面积和产量最大的国家[1]。马铃薯的遗传多样性可以从很多方面体现，包括形态特征、生理特征、细胞特征和DNA序列等，其中遗传多样性的本质是DNA多样性[2]，因此，应用分子标记技术对马铃薯进行DNA标记和遗传差异性分析显得至关重要。简单重复序列(simple sequence repeat，简称SSR)是一种应用较广泛的分子标记技术，该技术具有低成本、操作简单、重复性好、多态性高等优势，被广泛应用于新品种选育和遗传多样性研究[3-4]。de Galarreta等通过SSR分子标记聚类分析的方法，把西班牙当地105个马铃薯品种中具有相似特性的品种聚在了一起[5]。de Haan等利用SSR标记技术，比对了1 162份来自秘鲁中部的地方品种及外迁地方品种，通过15对SSR引物检测到173个等位位点[6]。谷青等利用5对SSR引物对河北省、黑龙江省、辽宁省、宁夏回族自治区和内蒙古自治区5个地区的74株马铃薯早疫病病菌进行SSR标记，共检测到26个等位位点[7]。李靓等利用10对SSR引物扩增6份马铃薯新品系，共扩增出105个等位位点，其中多态性位点82个，多态性比率为78.1%[8]。李建武等利用11对多态性高、谱带清晰SSR的引物分析了甘肃省42份马铃薯主栽品种的遗传多样性，结果表明，42份马铃薯品种之间的遗传基础较狭窄，遗传相似性较高[9]。李国彬等利用SSR引物和细胞质DNA引物对云南省79份马铃薯品种进行遗传多样性分析，分析了不同马铃薯品种的细胞质类型并构建了指纹图谱[10]。种质资源鉴定、资源收集、种质保存和创新利用是拓展品种遗传基础、不断提高育种水平的重要条件和紧迫任务[11-12]。SSR分子标记技术在马铃薯的遗传多样性研究和种质资源鉴定的应用已逐渐成熟，本研究利用形态学鉴定和SSR分子标记鉴定技术对20份马铃薯材料进行遗传多样性分析，解析品种间的亲缘关系，并初步构建了20份马铃薯材料的指纹图谱，为马铃薯种质资源的保护利用、亲缘关系分析及品种鉴定提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

20份马铃薯材料来自国际马铃薯研究中心(CIP)、中国农业科学院蔬菜花卉所、河北北方学院旱作农业研究中心等马铃薯选育单位(表1)。

1.2 试验地点

试验于2021年5—9月在河北省张家口市河北北方学院马铃育种试验基地(114°21′20.69″)进行。该地区属中温带大陆性季风气候，海拔1 600～1 800 m，年降水量300 mm左右。试验地为栗钙土，土壤肥力中等，年平均日照时数2 897.8 h。

1.3 试验方法

选取20份马铃薯品种(系)，随机排列种植，每份品种(系)种植面积108 m2(30 m×3.6 m)，起垄种植，垄宽90 cm，种植密度52 500株/hm2。播种前施复合肥(N ∶P2O5∶K2O=1 ∶0.5 ∶2.5)1 500 kg/hm2，不追肥，正常田间管理，2021年5月7日播种，9月18日收获。

表1 供试马铃薯品种(系)资源

1.4 测定项目及方法

1.4.1 田间表型性状调查及赋值方法 参考《马铃薯种质资源描述规范和数据标准》[13]和《马铃薯DUS测试指南》的分级标准[14]，对供试材料19个田间性状进行调查并赋值，具体性状及赋值方法见表2。采用SPSS 22.0统计软件，通过描述统计模块，对所有形态学性状鉴定的数据进行标准化处理，之后将标准化的数据输入处理软件SPSS 22.0，采用欧氏距离，利用UPGMA法对供试材料进行聚类，生成聚类图。

1.4.2 马铃薯基因组DNA的提取与SSR-PCR扩增 摘取未感病虫害的马铃薯幼嫩叶片，采用改良的CTAB法提取基因组DNA。12对SSR引物均来自段艳凤等马铃薯科研工作者公开发表的文献[15]，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成(表3)，用于对供试马铃薯材料进行扩增。PCR扩增体系为 25 μL，包括模板DNA 2 μL、GreenTaqMix 10 μL(来自南京诺唯赞生物科技有限公司)、上下游引物各 1 μL、ddH2O 11 μL。扩增程序为94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸 10 min。用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物，恒定电压1 800 V，电泳时间90 min，并用硝酸银染色，氢氧化钠显色，拍照记录结果。

表2 19个马铃薯田间性状及其赋值方法

1.4.3 SSR分子标记聚类分析 以12对SSR引物对供试材料进行扩增，采取人工的方法对扩增出的条带进行统计，在相同的位置，扩增迁移出条带的记为“1”，无条带或条带模糊的记为“0”，构成(1，0)矩阵。使用软件NTSYS 2.10进行遗传距离分析，计算供试材料之间的遗传距离，并使用UPGMA进行聚类分析，绘制聚类图。

2 结果与分析

2.1 基于19个表型性状的聚类分析

基于欧氏距离按UPGMA方法，对20份马铃薯品种(系)的19个基本形态学性状进行聚类分析研究(图1)。结果表明，在欧氏距离19.6处可将供试材料分为3个类群。第Ⅰ类包括4份材料，分别为万紫千红、BJ16、陇薯309、宣薯4号；第Ⅱ类包括2份材料， 分别是东农311、云薯1号；其他14份材料聚为第Ⅲ类。

表3 12对SSR引物信息

2.2 12对SSR引物扩增结果分析

以20份马铃薯品种(系)的DNA为模板，利用12对多态性丰富、条带清晰的SSR引物对其DNA进行扩增，结果见图2和表4。12对SSR引物共扩增出91个等位位点，其中多态性位点87个，多态性比率95.6%，平均每对引物扩增7.6个等位位点，7.3个多态性位点。12对SSR引物扩增出的等位位点在3～20个之间，多态性位点在1～19个之间，多态性比率在33.3%～100.0%之间。

2.3 20份马铃薯材料的遗传距离分析

使用NTSYS 2.10软件计算遗传距离(表5)，20份马铃薯品种(系)间的遗传距离范围在0.148 1～0.655 2，平均遗传距离0.486 9，说明供试材料的遗传背景差距明显。其中遗传距离最近的是荷十四、中薯18号，遗传距离为0.148 1，遗传距离最远的是2014-89-47、丽薯6号，遗传距离为0.655 2。

2.4 基于SSR分子标记的聚类分析

SSR分子标记聚类分析(图3)结果表明，20份马铃薯品种(系)的聚类结果与其遗传关系基本保持一致，在遗传相似系数为0.51时，可将供试材料分为3个类群。第Ⅰ类包括万紫千红1份材料； 第Ⅱ类包括2014-89-61、2014-89-47、2011-5-21、BJ16、宣薯4号、荷十四、晋薯15号、中薯18号8份材料；第Ⅲ类包括夏坡蒂、陇薯309、东农311、德薯3号、青薯168、定薯1号、天薯12号、毕薯4号、蒙薯19号、丽薯6号、云薯1号11份材料。

表4 12对SSR引物扩增结果

2.5 20份马铃薯材料的指纹图谱构建

根据SSR引物标记结果，挑选出多态性好、条带清晰、重复性高的SSR引物，构建20份马铃薯材料指纹图谱。引物STM1052可以鉴别夏坡蒂、2014-89-61、万紫千红、BJ16、东农311、德薯3号、宣薯4号、天薯12号、毕薯4号、蒙薯19号、中薯18号、丽薯6号12份供试材料；引物S25可以鉴别万紫千红、2011-5-21、BJ16、东农311、德薯3号、毕薯4号、蒙薯19号、丽薯6号8份供试材料；结合引物STM1052和引物S25的扩增结果构建指纹图谱(表6)，可以把20份供试材料完全区分开。

表6 20份供试马铃薯材料的SSR指纹图谱

3 讨论与结论

表型性状聚类结果表明，表型性状聚类分析可以较为准确地区分具有显著形态差异的马铃薯材料，如在表型聚类中，类群Ⅰ的材料花繁茂、薯皮光滑、分支数少等；类群Ⅲ的材料绝大多数植株高、单株产量高、叶绿素含量高等。在徐敏的研究结果中，表型聚类的群体3中的材料薯形圆形、薯皮黄色、芽眼较深，群体4花繁茂性强、花粉量大、薯肉为白色[16]，本研究结果与之相似。

SSR分子标记聚类结果表明，地理来源不同的马铃薯材料，在聚类图中也可能被聚合为一类，如荷十四、晋薯15号、中薯18号被聚合在类群Ⅱ；德薯3号、天薯12号、蒙薯19号被聚合在类群Ⅲ，与王鹏等的研究中，天薯12号、蒙薯19号被聚合在一个类群结果[17]相似。同一育种单位选育的马铃薯材料遗传差异较小，如由河北北方学院旱作农业研究中心育成的材料2014-89-61、2014-89-47、2011-5-21亲缘关系较近，张招娟等研究发现，品种间亲缘关系的远近程度与育种单位有一定的相关性[18]，本试验结果与之相近。

大多数马铃薯材料在表型性状聚类图上和SSR标记聚类图上都被聚到一个类群当中，如青薯168、定薯1号、天薯12号、毕薯4号、蒙薯19号、丽薯6号在2种聚类图中都聚合到一起，2014-89-61、2014-89-47、2011-5-21在2种聚类图中也都聚合到一起。表明SSR分子标记聚类分析结果和表型性状聚类分析结果具有一定的一致性，植物表型性状的差别也能够相应反映基因水平的差别。部分马铃薯材料在2种聚类分析结果上表现出差异，刘福翠等研究认为，外界环境的改变容易使马铃薯性状发生改变，从而使马铃薯基因型发生变异，表现型发生变化，最终导致SSR分子标记结果与形态学标记结果产生差别[19]。段绍光等研究表明，马铃薯是同源四倍体，其高度杂合的特性，决定了表型性状聚类分析不能从本质上反映马铃薯的遗传差异，只能反映出不同材料之间表型性状的差异[20]。本试验SSR分子标记聚类图中万紫千红与其他材料亲缘关系较远，单独聚为一类，而在表型性转聚类图中万紫千红、BJ16、陇薯309、宣薯4号则被聚为一个类群，产生此结果的原因可能是土壤、水、气候等不同环境因素共同影响了植物的形态学性状，导致2种聚类分析结果产生差异。

本试验采用20份马铃薯品种(系)为供试材料，通过19个表型性状和12对SSR引物对供试材料进行了表型性状聚类分析和SSR分子标记聚类分析，并利用2对核心引物(STM1052和S25)构建了供试材料的DNA指纹图谱，为马铃薯种质资源的利用、亲缘关系分析及品种鉴定提供了理论依据。