电子束对藏药十一味能消丸的辐照效应*

王玮 德吉卓嘎 白央 田蕾 兰利琼 陈浩 孙群 高鹏**

（1.西藏自治区食品药品检验研究院；2.国家药品监督管理局中药（藏药）质量控制重点实验室，西藏 拉萨 850000；3.四川大学生命科学学院；4.四川省原子能研究院；5.辐照保藏四川省重点实验室，四川 成都 610000）

藏医药学是中国医学宝库中的重要的一部分，是颇具代表性的优秀传统文化，也是世人普遍公认的中华民族医药宝库中一颗璀璨明珠，藏医药学也是迄今世界医学中原始形态保存最完好的医学之一[1，2]。藏医药学在不断实践中得到传承与创新，时至今日，自身已发展成为一套完整且科学的医学体系[3]。其中藏成药组方独特，通常处方药味众多，动物和矿物药材使用广泛，以其独特的工艺成为藏医药最为独特的一面[4]。藏药十一味能消丸为典型的藏药水丸剂，其主要成分为藏木香、小叶莲、干姜、沙棘膏、诃子肉、蛇肉（制）、大黄、方海、北寒水石、硇砂、碱花（制），主要用于化瘀行血，通经催产，经闭，月经不调，难产，胎盘不下，产后瘀血腹痛[5]。十一味能消丸中主要成分大黄是多种蓼科大黄属的多年生植物，具有止血、调节血脂、免疫调控等功效。本研究主要以测定其中大黄素和大黄酚在辐照前后的变化为研究基准[6]。

藏药近几年虽然发展快速，但其微生物污染问题比较突出，已较为明显地影响到藏药的生产、销售和品质，为藏药固体制剂寻求一种经济、高效的灭菌方法已迫在眉睫[7]。目前常用的中药灭菌方法包括干热灭菌、湿热灭菌、辐照灭菌、和环氧乙烷气体灭菌等，这些方法各有其特点[8]。辐射灭菌法被称为“冷灭菌”，不会引起被辐照物明显温度升高，对有挥发性和热敏性中药的杀菌有突出的优越性[9-11]。辐照灭菌中常用的辐照源有60Co-γ射线和电子束，其中60Co-γ射线辐照灭菌具有高效、操作简单，穿透力强等优点，但存在射线利用率不高、放射核素衰减、特别是辐射源运输、贮存和废源处理等安全问题[12]。电子束辐照具有操作安全简便、穿透性强、加工效率高、安全环保、装备易于安装等特点，特别是其具有更易于质量控制、无核废料等优点，工作后可关闭[13-17]。目前，辐照灭菌所用剂量一般参照2015 年版《中药辐照灭菌技术指导原则》，其中规定中药最大总体平均辐照剂量原则上不超过10 kGy。

综合考虑辐照技术的发展趋势和安全环保问题，本研究通过不同剂量的电子束辐照处理藏药十一味能消丸，研究电子束辐照对藏药十一味能消丸的辐照灭菌效果和有效成分的影响，同时与7 kGy 的60Co-γ射线辐照处理组比较，探究不同类型射线的辐照效应，以期为电子束辐照技术在藏药十一味能消丸的灭菌处理的应用提供科学依据。

1 材料

1.1 材料与试剂

十一味能消丸（A 企业，批号为20150，选自拉萨市；B 企业，批号为20210301，选自山南地区；C 企业，批号为151217，选自阿里地区），样品选取以地区差异性和生产工艺差异性为首要考虑条件。

大黄酚（纯度为99.4%，中国食品药品检定研究院，批号为110796-201922）；大黄素（纯度为96.0%，中国食品药品检定研究院，批号为110756-201913）；甲醇（色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司，批号为206403）；硫酸（AR，批号为20110808）；磷酸（AR，批号为2016080201）；三氯甲烷（AR，批号为2020021901），无水硫酸钠（批号为20130220）。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪（Waters）2695（美国沃特斯公司，出厂编号为K10SM4214A）；HTY-761 匀浆仪（浙江泰林生物技术股份有限公司）；电子天平（瑞士梅特勒公司，型号为AE200,精度为万分之一）；微量电子天平（瑞士梅特勒公司，型号为XP205,精度为十万分之一）；电子天平（德国赛多利斯公司，型号为BSA2202S-CW，精度为百分之一）；电热恒温水浴锅（上海齐欣科学仪器有限公司，型号为HWS-26）；数显式电热恒温三用箱（上海跃进医疗器械厂，型号为S·HH·W21·420S）；隔水式恒温培养箱（上海一恒，型号为CHP-9270N）；隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂，型号PYX-DHS-60×75）；霉菌培养箱（上海一恒，型号为MJ-250Ⅱ）；高压蒸汽灭菌器（重庆雅马拓公司，型号为SQ810C）。

1.3 培养基和菌种

胰酪大豆胨液体培养基（TSB，批号为200224）；胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA，批号为200709）；沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号为201214）；RV 沙门菌增菌液体培养基（批号为190823）；木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（批号为190627）；麦康凯液体培养基（批号为210218）；麦康凯琼脂培养基（批号为201214）；肠道菌增菌液体培养基（批号为191231）；紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（批号为191224）；以上培养基选用品牌为“北京陆桥”。大肠埃希菌（Escherichia coli）〔CMCC（B）44 102〕；乙型副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi B）〔CMCC（B）50 094〕；以上菌种由中国食品药品检定研究院提供。

2 方法

2.1 样品准备与辐照处理

首先，将三个厂家的样品进行分装，分装15 份，每份40 g，以无菌采样袋密封，准备辐照处理。电子束辐照处理样品在四川润祥辐照技术有限公司进行（高能电子加速器，10 MeV，20 KW），60Co-γ 辐照处理样品于四川省原子能研究院开展。每个厂家的样品中3 份不做任何操作，作为对照组（0 kGy）；其余12份分别以电子加速器5kGy、7kGy、10kGy，以及60Co-γ 的7 kGy 进行辐照灭菌处理，作为试验组。根据《中国药典》的检测方法要求，每组样品后续测试都进行2 次平行试验。试验组样品在辐照后将每个吸收剂量中的1 份立即进行在49 ℃下加速贮藏3个月处理，后续与试验组进行相同的含量检测和微生物检测。

2.2 微生物限度测定

按2020版《中国药典（四）部）》非无菌产品微生物限度检查（通则1105）：微生物计数法；非无菌产品微生物限度检测（通则1105）：控制菌检查法；非无菌药品微生物限度标准（通则1107）[5]。按照上述方法对对照组和试验组进行需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数及控制菌进行检测，同时接种大肠埃希氏菌和乙型副伤寒沙门菌观察阳性对照反应。

2.3 含量测定

按2020 版《中国药典（一部）》中“十一味能消丸”下“含量测定”方法对辐照前后样品进行有效成分“大黄酚”“大黄素”及总和测定[5]。

2.4 统计学分析

采用Graphpad Prism 8 软件对试验数据进行分析，试验数据以平均值±标准差表示（M±SD）。

3 结果与分析

3.1 灭菌前后性状观察

经观察，A、B、C 三个厂家样品辐照前后无明显差异，均为棕色至黄褐色的水丸，气微，味咸、微苦、涩。

图1 不同吸收剂量处理后样品性状

3.2 微生物限度检测

样品经辐照后立即以及加速贮藏3个月后的微生物限度检测结果分别见表1和表2。可见，厂家A、C在未经辐照灭菌前微生物限度不符合2020版《中国药典（四）部）》非无菌药品微生物限度标准（通则1107）中非无菌含药材原粉的中药制剂微生物限度标准（丸剂需氧菌总数6×104CFU/g，霉菌、酵母菌总数200 CFU/g，控制菌大肠埃希菌和沙门菌不得检出，耐胆盐革兰氏阳性菌＜10 CFU/g）[5]，其中三个厂家样品控制菌未经辐照均都符合规定要求。经电子束5 kGy辐照处理厂家A、B均能符合《中国药典》规定要求，C厂家需氧菌总数和霉菌、酵母菌总数也有明显下降，且三个厂家微生物限度结果都已符合《中国药典》中的规定。由表2可看出，经过加速贮藏三月后样品中的微生物总数没有增殖。

表1 不同吸收剂量处理对十一味能消丸微生物存活数的影响

表2 不同吸收剂量处理十一味能消丸经49 ℃加速贮藏三个月后微生物存活数

3.3 有效成分含量测定

三个厂家十一味能消丸经不同吸收剂量处理后立即测定和加速贮藏后测定的大黄素、大黄酚、大黄素大黄酚总和结果见表3和表4。

表3 不同吸收剂量处理下十一味能消丸的活性成分即测含量

表4 不同吸收剂量处理十一味能消丸的活性成分在49 ℃加速贮藏后的含量

由结果看出，厂家A 样品在不同剂量电子束辐照后大黄素和大黄酚的含量没有明显变化；同一吸收剂量下，60Co-γ 辐照后样品中其含量与电子束辐照相比也无明显变化；厂家B 样品在不同剂量电子束辐照大黄素和大黄酚含量随着吸收剂量的增加有一定下降趋势；同一吸收剂量下，60Co-γ 辐照后样品中其含量与电子束辐照相比有下降趋势，但趋势不明显。同时，辐照后厂家C 样品中即测大黄素和大黄酚的含量没有明显变化，而加速贮藏后含量有明显下降趋势；同一吸收剂量下，60Co-γ 辐照后样品中其含量与电子束辐照相比有下降趋势。

由此可见，在5～10 kGy 的剂量范围内，电子束辐照对十二味能消丸的有效成分含量无明显影响；同一吸收剂量下，60Co-γ 辐照和电子束辐照对其有效成分含量的影响并无明显差异；加速贮存条件下，个别厂家的样品辐照后其有效成分含量有稍微下降，这跟贮藏条件、样品和生产工艺差异、有效成分具有光敏性等因素有一定相关性。

4 讨论

藏药多为生药原粉直接入药，较容易引入的微生物污染问题。当下湿热蒸汽灭菌和微波灭菌等技术均不能完全解决此问题，如含有挥发性药材的散剂，湿热蒸汽灭菌一方面导致挥发性成分损失而影响其药效，另一方面因吸湿、结块，容易影响后续生产工艺。藏药的微生物污染问题得不到有效解决，导致其按质量标准检验不合格，一定程度阻碍了藏药的推广、销售和使用。钴60在中药材辐照方面开展的研究已有多年历史，随着技术更新和装备升级，电子束辐照技术成为新兴的发展趋势，而电子束在产生机理、作用特征与伽马射线都存在实质性差异，其灭菌的生物学效应以及安全性等还未有系统性研究，因此，开展电子束在藏药灭菌中的应用研究具有重要实际意义。

本试验以藏药十一味能消丸为对象，研究了电子束对其辐照灭菌效果和有效成分的影响。研究结果表明：三个厂家的样品在辐照前后性状没有发生变化；经不同剂量处理后，电子束辐照和60Co-γ 辐照均能显著降低十一味能消丸内微生物的含量，且电子束吸收剂量5 kGy 就能满足将微生物数量降低至《中国药典》所规定的限度；在5～10 kGy的剂量范围内，电子束辐照对十一味能消丸的大黄素和大黄酚含量无明显影响；同一吸收剂量下，60Co-γ 辐照和电子束辐照对大黄素和大黄酚含量的影响并无明显差异（其中厂家B 样品中的含量随着吸收剂量增加而有所递减，但趋势不明显）；49℃加速贮藏3 个月后，厂家A、B 在原有吸收剂量影响基础上其有效成分含量没有发生明显变化，而厂家C 样品有所降低，分析原因可能有以下三点：（1）试验设计时样品的选择依据是有效成分的含量要有差异性，试验中的三个厂家来自西藏不同地区，原料药来源有差异性，生产工艺和水平也存在差距，可考察辐照对不同品质样品中有效成分的影响；（2）不同厂家成品药包装的差异性：A 厂家为铝塑包装，B、C 厂家为塑料透明包装；（3）大黄素和大黄酚为光敏物质，在辐照和加速贮藏过程中可能产生光学影响［18］。因此，在实际辐照灭菌过程中，一要严格按照《中国药典》要求，控制生产工艺和药品品质；二要根据药品性质特点和贮存条件要求进行包装，避免因操作不当造成药品损失。

综上，本研究结果显示电子束辐照技术对十一味能消丸微生物数量有显著降低作用，达到《中国药典》规定的微生物限度，而且对其有效成分含量和性状无显著影响，藏药十一味能消丸辐照灭菌的最佳电子束吸收剂量为5 kGy，此结果可为电子束作为藏药十一味能消丸的灭菌方式提供数据支持。另外，西藏作为国家重要的生态屏障，是我国重要河流的发源地，在生态环境保护与发展相协调的前提下［19］，电子束辐照灭菌在藏药加工生产中具有突出技术优势，本文结论也可为电子束在其它藏药辐照灭菌研究提供技术支撑。