双标多测法在脑心通胶囊5个成分含量测定中的应用

2022-12-09唐玉洁

食品与药品 2022年6期

唐玉洁，高原

（湖北文理学院附属医院（襄阳市中心医院），湖北襄阳 441021）

脑心通胶囊源于清代王清任《医林改错·卷下·瘫痿论》的补阳还五汤，是以补阳还五汤为基础加味虫类药和活血化瘀药[1]，由黄芪、赤芍、丹参、当归、川芎、红花等16味药材加工制成，具有益气活血、化瘀通络的功效[2]，是“脑心同治”理论的代表性方药，临床用于治疗脑梗死[3-5]、心肌梗死[6-7]、冠心病[5,8]、血管性痴呆[9]、原发性高血压[10]、急性肺栓塞[11]、糖尿病[12]及慢性心力衰竭[13-14]等疾病。现行质量标准的含量测定项下，采用外标法测定芍药苷和丹酚酸B含量，文献[15-18]对脑心通胶囊中多种成分进行检测，含量计算也采用外标法。外标法是成分含量测定过程中的一种传统的计算方法，在测定多种成分时需要对应的标准物质为参考。

随着更多的先进分析手段的运用，中药中更多的成分被发现，而部分化合物的标准物质由于制备过程复杂、价格昂贵或不稳定等因素无法获得，这影响到药品中这些成分的检测，从而导致药品中部分指标成分无法掌控的局面，给药品的质量评价和监督造成不少漏洞。多种中药标准物质替代方法能很好地解决标准物质短缺问题[19]，其中，双标多测法（two reference substances for determination of multiple components，TRSDMC）是采用双标线性校正法（linear calibration using two reference substances，LCTRS）原理，以两个化学单体标准物质作为参照成分，对多种成分的色谱峰进行定性后，采用校正因子法对多成分进行含量测定的一种方法。目前，该方法在中药成分分析领域运用较为广泛[20-22]。本研究建立脑心通胶囊中羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B和藁本内酯5个成分的双标多测法测定，该方法仅需羟基红花黄色素A、藁本内酯两种标准物质即可对其他3种成分进行定性分析，并在此基础上，使用阿魏酸作为参考，即可对其他4种成分进行定量分析，方法经济实用、准确可靠，可为脑心通胶囊的质量评价和监督提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

e2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；1260 Infinity型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Ultimate 3000型高效液相色谱仪（美国赛默飞世尔公司）；AB135-S型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；DTA-27超声波清洗器（超声功率700 W，频率40 kHz，湖北鼎泰高科有限公司）。

色谱柱1：资生堂CAPCELL PAK C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；色谱柱2：GL Sciences Inertsil ODS-3（150 mm×4.6 mm，5 μm）；色谱柱3：迪马 Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；色谱柱4：月旭Ultimate XB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；色谱柱5：安捷伦Zorbax C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；色谱柱6：岛津VP-ODS（150 mm×4.6 mm，5 μm）；色谱柱7：岛津Inertsil ODS-SP（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

1.2 试药

脑心通胶囊市售6批，陕西步长制药有限公司生产，规格：0.4 g/粒，批号：20200205，20200301，20200602，20210201，20210205，20210705；羟基红花黄色素A对照品（批号：111637-201810，纯度：93.1 %），芍药苷对照品（批号：110736-202044，纯度：96.8 %），阿魏酸对照品（批号：110773-201915，纯度：99.4 %），丹酚酸B对照品（批号：111562-201917，纯度：96.6 %），藁本内酯对照品（批号：111737-201910，纯度：≥95.0 %，中国食品药品检定研究院）；甲醇、乙腈均为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱1；流动相：乙腈（A）-0.5 %甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～8 min，5 %A→15 %A；8～20 min， 15 %A；20～36 min，15 %→40 %A；36～50 min，40 %→45 %A；50～60 min， 45 %A；60～75 min，45 %→70 %A；75～80 min，70 %A；80～85 min，70 %→8 %A）；流速：1.0 ml/min；检测波长：403 nm（0～30 min，检测羟基红花黄色素A），240 nm（30～42 min，芍药苷），280 nm（50～70 min，丹酚酸B），324 nm（42～50 min及70～85 min，阿魏酸和藁本内酯）；进样量：20.00 μl；柱温：35 ℃。

2.2 方法学考察

2.2.1 混合对照品溶液制备分别精密称取羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B、藁本内酯对照品各适量，以70 %甲醇制成每1 ml含羟基红花黄色素A 0.043 mg、芍药苷0.199 mg、阿魏酸0.013 mg、丹酚酸B 0.523 mg、藁本内酯0.228 mg的混合对照品贮备溶液。精密量取对照品贮备液1 ml 至10 ml量瓶中，加70 %甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得混合对照品溶液，备用。

2.2.2 供试品溶液制备取脑心通胶囊10粒，将内容物混合均匀，精密称取0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入70 %甲醇50 ml，称重，超声处理（功率：5000 W，频率：40 kHz）30 min，取出，放冷至室温，用70 %甲醇补足减失的重量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液，备用。

2.2.3 系统适用性试验精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各20 μl，按2.1项色谱条件进样测定，结果见图1。色谱图中，羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B和藁本内酯与相邻色谱峰均分离完全（＞1.5），理论塔板数按羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B和藁本内酯计均大于5000。

图1 系统适用性试验HPLC图谱

2.2.4 线性关系考察精密量取2.2.1项下混合对照品贮备溶液0.5，1.0，2.0，5.0，8.0，10.0 ml，分别置于25 ml量瓶中，加70 %甲醇稀释至刻度，摇匀，得到系列浓度标准曲线考察溶液。采用色谱柱1，按2.1项下色谱条件测定，记录色谱图峰面积，以各成分质量浓度（x，μg/ml）为横坐标，各峰面积（y）为纵坐标，进行线性回归，绘制各成分标准曲线，计算其线性回归方程和相关系数，结果见表1。结果表明：羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B和藁本内酯的线性关系良好，符合含量测定要求。精密吸取混合对照品溶液，用70 %甲醇倍比稀释，按2.1项下色谱条件测定，以信噪比（S/N）为10:1时样品浓度为定量限（LOQ），结果见表1。

表1 线性关系考察及定量限测定结果

2.2.5 精密度试验精密吸取混合对照品溶液20 μl，采用色谱柱1，按2.1项下色谱条件，连续进样6针，记录色谱图保留时间和峰面积。结果羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B和藁本内酯保留时间基本一致，峰面积的RSD分别0.3 %，0.2 %，0.1 %，0.4 %，0.3 %（n=6），表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验取同一批脑心通胶囊溶液（批号：20200205），采用色谱柱1，按2.1项下色谱条件，分别于0，3，6，9，12，15，24 h测定分析，记录色谱图保留时间和峰面积。结果羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B和藁本内酯保留时间基本一致，峰面积的RSD分别0.7 %，1.0 %，0.5 %，1.3 %，0.8 %（n=7），表明24 h内供试品溶液稳定。

2.2.7 重复性试验取同一批脑心通胶囊内容物（批号：20200205），按2.2.2项下方法制备供试品溶液，平行制备6份，采用色谱柱1，按2.1项下色谱条件测定，记录色谱图保留时间和峰面积。结果羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B和藁本内酯保留时间基本一致，按标准曲线法，以峰面积计算各成分平均含量分别为0.455，1.992，0.137，5.328，2.3188 mg/g，平均含量的RSD分别0.5 %，0.4 %，0.5 %，0.9 %，1.0 %（n=6），表明方法重复性良好。

2.2.8 加样回收试验取已知含量的脑心通胶囊内容物（批号：20200205），精密称取0.25 g，共6份，置于具塞锥形瓶中，分别加入2.2.2项下混合对照品贮备溶液2.5 ml，按2.2.1项下方法制备供试品溶液，采用色谱柱1，再按2.1项下色谱条件测定，记录色谱图峰面积，计算各成分加样回收率及RSD值，结果见表2。结果表明羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B和藁本内酯加样回收率良好，适合本试验要求。

表2 加样回收试验结果（n=6）

2.3 双标线性校正法定性研究[22-23]

2.3.1 色谱柱适用性考察取2.2.2项下同一批脑心通胶囊（批号：20200205）供试品溶液，采用色谱柱1～6，按2.1项下色谱条件测定，记录各成分色谱峰保留时间，计算各峰保留时间平均值，结果见表3。以各成分在不同色谱柱上保留时间平均值即标准保留时间（standard retention time，SRT）为横坐标，以各成分在各色谱柱上实际保留时间为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线，计算其线性回归方程和相关系数，结果见表4。结果羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B和藁本内酯在各色谱柱上都能分离完全，SRT分别为12.067，28.421，31.191，41.480，54.027 min，5成分在6根色谱柱上的实际保留时间与SRT呈良好线性关系。

表3 不同色谱柱上5成分的保留时间

表4 5种成分在不同色谱柱上保留时间关系

2.3.2 双标线性校正法定位化合物取2.2.1项下混合对照品溶液及2.2.2项下同一批脑心通胶囊（批号：20200205）供试品溶液，采用色谱柱7，按2.1项下色谱条件测定，记录各成分色谱峰保留时间。设置羟基红花黄色素A和藁本内酯为双标化合物，以混合对照品溶液色谱图中羟基红花黄色素A（18.152 min）和藁本内酯（81.54 min）保留时间为横坐标，供试品色谱图中两成分实际保留时间（红花黄色素A为17.789，藁本内酯为79.902 min）为纵坐标，进行线性回归，得到两点线性方程为y=0.9799x+0.0022，将芍药苷，阿魏酸，丹酚酸B保留时间代入线性方程，推算出供试品色谱图中芍药苷（42.842 min），阿魏酸（47.070 min），丹酚酸B（62.605 min）的理论保留时间分别为41.983，46.126，61.349 min，与供试品色谱图中芍药苷，阿魏酸，丹酚酸B 3化合物实际保留时间比较，相对偏差均小于0.2 %，说明在色谱柱7上采用双标线性校正法进行色谱峰定性分析可行。

2.3.3 双标线性校正法与相对保留时间法的对比双标线性校正法以羟基红花黄色素A和藁本内酯为双标化合物，芍药苷和丹酚酸B预测保留时间绝对误差分别为0.056，0.034 min；相对保留时间法以中间峰阿魏酸为参照物，芍药苷和丹酚酸B预测保留时间绝对误差分别为1.032，1.089 min。结果表明，双标线性校正法较相对保留时间法的预测值绝对偏差低，该方法对色谱柱的适用性更强，对色谱峰的定性分析更加准确。

2.4 校正因子法定量研究

2.4.1 相对校正因子的计算以阿魏酸为内参物计算羟基红花黄色素A、芍药苷、丹酚酸B和藁本内酯的相对校正因子。取2.2.1项下混合对照品溶液1，4，8，12，24，36，48 μl，采用色谱柱1，按2.1项下色谱条件测定，记录各成分色谱峰的峰面积，按下式计算相对校正因子平均值。结果见表5。

表5 脑心通胶囊中4种成分相对校正因子

式中S为内参物，T为其他成分，A为峰面积，C为各成分质量浓度。

2.4.2 相对校正因子重现性考察为验证相对校正因子重现性，分别考察Waters公司e2695型高效液相色谱仪（色谱仪1），Agilent公司1260 Infinity型高效液相色谱仪（色谱仪2），赛默飞世尔公司Ultimate3000型高效液相色谱仪（色谱仪3）3台色谱仪及3根不同品牌色谱柱（色谱柱1～3）对相对校正因子的影响，结果显示不同品牌高效液相色谱仪和不同型号色谱柱对羟基红花黄色素A、芍药苷、丹酚酸B和藁本内酯的相对校正因子的影响不大（RSD依次为0.34 %，0.76 %，0.50 %，0.62 %，均小于1.0 %），相对校正因子重现性好。结果见表6。

2.4.3 双标线性校正法与外标法结果比较采用色谱柱1，按2.1项下色谱条件，分别精密吸取2.2.1项下混合对照品溶液和2.2.2项下6批供试品溶液各20 μl，记录各成分色谱图峰面积，分别采用双标线性校正法与外标法对脑心通胶囊中羟基红花黄色素A，芍药苷，丹酚酸B和藁本内酯的含量进行测定，结果见表7。经SPSS 22.0软件对含量结果进行成组配对t检验，结果羟基红花黄色素A、芍药苷、丹酚酸B和藁本内酯4成分含量差异P值均大于0.05，表明两种含量测定方法无显著差异。

3 讨论

3.1 色谱条件优化

本实验采用DAD检测器，在190～400 nm范围内对5种成分进行光谱扫描，结果显示羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B和藁本内酯5成分最大吸收位置差异较大，因此本研究采用波长切换方法进行含量测定，即0～30 min设置波长为203 nm（检测羟基红花黄色素A），30～42 min设置波长为240 nm（检测芍药苷），50～70 min设置波长为280 nm（检测丹酚酸B），42～50 min及70～85 min，设置波长为324 nm（检测阿魏酸和藁本内酯）。流动相考察过程中，先后考察甲醇-0.1 %磷酸水溶液，乙腈-0.1 %醋酸水溶液，乙腈-0.5 %甲酸水溶液及乙腈-0.1 mol/L磷酸二氢钾溶液等系统，结果显示乙腈-0.5 %甲酸水溶液流动相系统对供试品中各成分分离效果最佳，因此本研究采用乙腈-0.5 %甲酸水溶液流动相系统进行梯度洗脱。

3.2 双标多测法含量结果分析

目前对于色谱峰定位，中国药典中收录的品种多采用相对保留时间法，本研究结果显示，此方法较双标线性校正法误差大，不同型号的色谱柱的耐用性也较差。由表7可见，双标多测法和外标法含量测定结果差异很小，但外标法往往需要与目标化合物相同数量的标准物质参与试验，双标多测法只需两种标准物质即可，由此可见，双标多侧法不仅可节省实验成本，还可减少试验操作步骤，减少误差，方法简便实用，可为客观、多指标评价中药质量提供重要手段。