HPLC-DAD同时测定少阳感冒颗粒中8个成分的含量

杨 蕾

（首都医科大学附属北京世纪坛医院，北京 100038）

少阳感冒颗粒是由柴胡、黄芩、人参、甘草、半夏、干姜、大枣和青蒿8味药材组成，具有解表散热，和解少阳之功效。常用于外感病邪犯少阳证，症见寒热往来、胸胁苦满、食欲不振、心烦喜呕、口苦咽干等症[1]。方中柴胡具有疏散退热，疏肝解郁，升举阳气等功效，其中柴胡皂苷是柴胡的主要活性成分[2]；黄芩具有清热燥湿，泻火解毒等功效，黄酮类物质是黄芩中重要活性成分[3]；人参具有大补元气，复脉固脱，补脾益肺等功效，人参皂苷是人参中重要的活性物质，因此人参皂苷的含量是评价人参内在质量的重要指标之一[4]；甘草是一味应用极广的药材，具有补脾和胃，调和诸药等功效，有效成分包括黄酮类、三萜类和多糖类物质[5]；干姜是常用的药食同源中药材，以6-姜辣素为代表的姜辣素类物质具有性热味辛，温中散寒，回阳通脉，温肺化饮等功效[6]。少阳感冒颗粒现行标准仅对黄芩苷含量进行控制，目前对该品种其他成分含量测定报道较少[1,7]。为更全面、客观地反应该品种质量，本研究基于2020年版《中国药典》一部中上述5味药材含量测定项下的指标成分，结合各成分的提取率、稳定性等，确定以黄芩苷、甘草苷、甘草酸铵、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、6-姜辣素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d作为少阳感冒颗粒的指标成分，采用高效液相色谱-二极管阵列检测（HPLC-DAD）同时测定上述8个成分含量，以期提供多指标评价该制剂质量的方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 高效液相色谱仪（配置DAD 检测器，美国安捷伦公司）；XPE-205电子分析天平（d=0.001 mg，瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ-100VDB 三频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

8批少阳感冒颗粒（吉林长白山药业集团股份有限公司，批号：20201123，20210308，20210107，20201212；广东在田药业有限公司，批号：200911，201204，210122，210223，规格均为8 g/袋）；黄芩苷对照品（批号：110715-201821，含量：95.4 %），甘草苷对照品（批号：111610-201908，含量：95.0 %），甘草酸铵对照品（批号：110731-202021，含量：96.2 %），人参皂苷Rg1对照品（批号：110703-202034，含量：94.0 %），人参皂苷Re对照品（批号：110754-202028，含量：93.9 %），6-姜辣素对照品（批号：111833-202007，含量：99.3 %），柴胡皂苷a对照品（批号：110777-201912，含量：94.8 %），柴胡皂苷d对照品（批号：110778-201912，含量：96.3 %）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈，甲醇均为色谱纯（美国默克公司）；其余试剂为分析纯，水为二次蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[8-9]

色谱柱：Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.2 %磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～9 min，10 %A；9～23 min，10 %→23 %A；23～40 min，23 %→45 %A；40～51 min，45 %→30 %A；51～60 min，30 %→10 %A）；流速：1.0 ml/min；检测波长：1～7 min为280 nm（检测黄芩苷），7～20 min为237 nm（检测甘草苷），20～26 min为210 nm（检测人参皂苷Rg1、人参皂苷Re），26～30 min为237 nm（检测甘草酸铵），30～45 min为280 nm（检测6-姜辣素），45～60 min为210 nm（检测柴胡皂苷a和柴胡皂苷d）；柱温：30 ℃；进样量：20 μl；运行时间：60 min。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 分别取黄芩苷、甘草苷、甘草酸铵、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、6-姜辣素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d对照品各适量，精密称定，加70 %甲醇溶液溶解并稀释制成每1 ml含黄芩苷1512.4 μg、甘草苷604.8 μg、甘草酸铵901.6 μg、人参皂苷Rg1401.7 μg 、人参皂苷Re 455.6 μg、6-姜辣素700.5 μg、柴胡皂苷a 856.5 μg和柴胡皂苷d 120.9 μg的混合对照品储备液，精密量取上述储备液2 ml，置100 ml量瓶中，用70 %甲醇溶液稀释至刻度，即得。

2.2.2 供试品溶液[1,10]取样品适量，研细，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70 % 甲醇溶液100 ml，密塞，称定重量，回流30 min，放冷，再称定重量，用70 %甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液 按处方比例制备缺柴胡、黄芩、人参、甘草和干姜的阴性样品，并按2.2.2项下方法制备阴性对照溶液。

2.3 专属性试验

分别吸取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，按2.1项下色谱条件进样分析，结果见图1。结果表明，供试品溶液的色谱图中，在与混合对照品溶液色谱图相应的位置上，有相同保留时间的色谱峰，且黄芩苷、甘草苷、甘草酸铵、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、6-姜辣素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d峰与相邻色谱峰分离度良好；阴性对照溶液在各保留时间处无干扰。

图1 HPLC图谱

2.4 线性关系考察

取2.2.1项下混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件，分别进样5，10，20，50，100 μl，测定；以黄芩苷、甘草苷、甘草酸铵、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、6-姜辣素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的进样量（X，μg）为横坐标，色谱峰的峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，计算回归方程，结果见表1。结果表明，混合对照品溶液中8种成分在其对应的进样量范围内与峰面积呈良好线性关系。

表1 8个成分的线性关系考察

2.5 精密度试验

取2.2.1项下混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样6次，计算8个活性成分的峰面积RSD值。结果得黄芩苷、甘草苷、甘草酸铵、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、6-姜辣素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d峰面积RSD分别为1.52 %，0.74 %，1.23 %，1.15 %，0.66 %，1.26 %，0.91 %，0.70 %（n=6），表明该仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取2.2.2项下供试品溶液（批号：20201123），分别于室温放置0，2，4，8，16，24 h后，按2.1项下色谱条件进样分析，记录峰面积。结果黄芩苷、甘草苷、甘草酸铵、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、6-姜辣素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d峰面积的RSD分别为1.74 %，0.98 %，0.83 %，1.38 %，1.22 %，1.04 %，0.76 %，1.24 %（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取样品（批号：20201123）适量，按2.2.2项下方法平行制备6份供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样分析，记录色谱图。结果，黄芩苷、甘草苷、甘草酸铵、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、6-姜辣素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的平均含量分别为5.7634，2.3703，3.6514，1.5292，1.8609，2.8285，3.4146，0.4463 mg/g，RSD分别1.01 %，0.96 %，0.83 %，1.25 %，1.78 %，1.43 %，1.82 %，0.90 %（n=6），表明方法重复性良好。

2.8 加样回收试验

取样品约0.25 g，共6份（批号：20201123），精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入2.2.1项下混合对照品储备液1 ml，按2.2.2项下方法制备加样回收供试品溶液，并按2.1项下色谱条件进样分析，记录峰面积。结果，黄芩苷、甘草苷、甘草酸铵、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、6-姜辣素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d平均回收率分别为99.1 %，99.0 %，100.7 %，98.7 %，101.1 %，100.6 %，101.6 %，98.8 %，RSD分别为1.10 %，1.05 %，0.38 %，0.70 %，1.24 %，1.01 %，0.55 %，1.57 %，见表2。结果表明，方法准确性良好。

表2 加样回收试验结果

表2 （续）

2.9 样品含量测定

取8批样品，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样分析，结果见表3。8批样品中黄芩苷含量均最高，柴胡皂苷d含量均最低；同一生产厂家生产的样品中同一成分含量差异较小，不同厂家之间同一成分含量差异较大。

表3 样品含量测定结果（n=3）

3 讨论

3.1 波长的选择[1,11-13]

采用DAD检测器，在200～400 nm波长范围内对2.2.1项下混合对照品溶液进行扫描。结果，黄芩苷在281 nm波长处有最大吸收，甘草苷和甘草酸铵分别在237 nm、239 nm波长处有最大吸收，6-姜辣素在278 nm波长处有最大吸收，人参皂苷Rg1和人参皂苷Re在204 nm波长处有最大吸收，柴胡皂苷a和柴胡皂苷d分别在209 nm和210nm波长处有最大吸收，人参皂苷Rg1和人参皂苷Re在最大吸收波长处测定的响应值与210 nm波长处测定的响应值差异不大。为减少频繁切换波长对基线造成的干扰，参考2020版《中国药典》一部黄芩苷、甘草苷、甘草酸铵、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、6-姜辣素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的检测波长，结合8种成分的出峰顺序及色谱峰强度，最终确定在280 nm波长处检测黄芩苷和6-姜辣素、237 nm波长处检测甘草苷和甘草酸铵、210 nm波长处检测人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d。试验采用波长切换法，既保证了各成分良好响应，也减少了检测器频繁切换对基线噪音的影响。

3.2 提取方法的选择

分别考察了70 %乙醇溶液、50 %甲醇溶液、70 %甲醇溶液和甲醇的提取效果。以70 %乙醇溶液作为提取溶剂时，人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和6-姜辣素色谱峰出现拖尾；用50 %甲醇溶液提取时，提取不完全；70 %甲醇溶液和甲醇作为提取溶剂时8个成分提取完全，无拖尾现象，甲醇提取杂质峰稍多，出现主峰与相邻色谱峰不能完全分离的情况，故采用70 %甲醇溶液作为提取溶剂。在此基础上，分别考察了超声和回流两种提取方式及不同提取时间对各成分提取率的影响。综合考虑各主峰的峰型、峰面积、分离度等因素。最终确定以70 %甲醇为提取溶剂，回流提取30 min作为供试品溶液的制备方法。

3.3 流动相的选择

在参考相关方法的基础上[14-16]，分别考察甲醇、乙腈有机相对色谱峰的影响，发现甲醇的洗脱能力优于乙腈；少阳感冒颗粒成分复杂多样，等度洗脱难以完全分离8个成分，最终确定以甲醇-0.2 %磷酸水溶液为流动相，按2.1项下方法梯度洗脱，能使待测组分得到很好分离。

综上，本文建立的HPLC-DAD法同时测定少阳感冒颗粒中黄芩苷、甘草苷、甘草酸铵、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、6-姜辣素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量，比现行标准更能全面、准确地反映药品质量，可为该制剂的质量标准提升提供方法学参考。