基于数据挖掘及网络药理学探讨中药治疗深静脉血栓用药规律及机制研究

仲瑞雪，季 欧，吴传红，段小云

（四川省骨科医院，四川 成都 610041）

深静脉血栓（deep venous thrombosis，DVT）是一种较常见的周围血管疾病，好发于下肢，如治疗不当，常引发患者肺部梗塞，严重者将危及生命[1-2]。相关研究表明，在无预防措施前提下，普通外科手术后患者发生DVT概率是10 %～40 %[3-4]。中医学认为DVT属于“股肿”“肿胀”“血瘀”等范畴，本病的主要病机特点是湿、热、瘀相互影响，常见的分型有湿热下注、气滞血瘀等。中药治疗DVT具有临床效果好、副作用小、适合长期服用等优势[5-6]。因此，本研究通过数据挖掘及网络药理学方法，分析总结中药治疗DVT的用药特点及核心药物的潜在作用机制，为DVT的临床用药及新药研发提供依据。

1 资料与方法

1.1 处方来源与筛选

检索2015～2020年CNKI数据库中收录的关于“中药”“深静脉血栓”等关键词的处方，根据《深静脉血栓形成的诊断和治疗指南》（第三版）[7]中对DVT的诊断标准，剔除不合格处方。

1.2 中药名称的规范

根据《中国药典》[8]及《中药学》[9]中规范的药物命名，对有效处方中药名进行梳理、规范。例如将处方中的“元胡”统一为“延胡索”，“将军”统一为“大黄”等。

1.3 数据统计与分析

采用双人核对制度将处方录入中医传承辅助平台（V2.5）（由中国中医科学院中药研究所研发），建立数据库。运用平台“数据分析”模块下选项，对处方进行频次统计、组方规律分析、关联规则分析及新方分析等。

1.4 网络药理学研究

采用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）筛选有效成分及靶点，并与人类基因综合分析数据库（GeneCards）、美国国家生物技术信息中心数据库（NCBI）及在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM）中DVT的靶点相映射并取交集，作为治疗DVT的潜在靶点。将上述靶点导入String数据库中，构建蛋白相互作用网络（PPI），筛选出关键靶点，并进行基因本体论（GO）生物过程分析及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。

2 结果

2.1 频次分析

本研究共纳入有效处方106首，其中包含120味药物，使用频次≥30的有14味，排前3位的分别是当归＞黄芪＞红花，见表1。

表1 治疗DVT药物使用情况（频次≥30）

2.2 归经分布

预防DVT常用药味归经分布多数为归肝、心、脾经，见表2。

表2 药物归经分析

2.3 组方规律

对数据预处理后，将支持度设为30，置信度设为0.70，得到常见药对组合。前3位分别是“红花→当归”、“黄芪→当归”及“川芎→当归”，见表3、表4。通过网络化展示其关联规律。其中红花、当归、黄芪等居于网络图中心位置，与常用药味组合吻合，见图1。

表3 处方中高频药物组合

表4 处方中药物组合关联规则（置信度≥0.70）

图1 关联规则网络化展示（支持度≥30 %，置信度≥0.70）

2.4 基于复杂系统熵聚类分析

设相关度=7，惩罚度=2，进行基于复杂系统熵的聚类分析，得到药味的常用组合，见表5。

表5 基于复杂系统熵聚类分析得到的常用药物组合

2.5 基于无监督的熵层次聚类分析

以2.4项下常用药味组合为研究对象，选择“聚类”选项下“提取新方组合”，共推荐10个层次聚类核心药物组合；再进一步选择“聚类”选项，得到5个推荐新方，见表6、表7；并得出网络关联图，见图2。

图2 治疗DVT的新方药物网络关联图

表6 基于无监督的熵层次聚类分析得到的核心药物组合

表7 基于无监督的熵层次聚类分析得到的新方组合

2.6 网络药理学研究

2.6.1 活性成分及作用靶点的筛选 通过TCMSP检索当归、黄芪及红花的化合物成分（OB≥30 %，DL≥0.18）及靶点预测，再经Uniprot数据校正，去掉非人类靶点及删重后，当归获得2个化合物成分，51个靶点；黄芪获得20个化合物成分，194个靶点；红花获得22个化合物成分，203个靶点。

2.6.2 药物-疾病共同靶点交集 以“Deep venous thrombosis”为关键词，在GeneCards，NCBI及OMIM数据库进行人类基因检索。将3个数据库的基因合并删重，共得到1783个DVT相关基因。输入Venny 2.1软件制作韦恩图，得到136个共有靶点，见图3。

图3 药物-疾病交集靶点韦恩图

2.6.3 PPI网络的构建 将共有靶点输入String数据库，生物种类设为“Homo sapiens”，得到136个节点，2808条边，平均度值为41.3，运用Cytoscape软件绘制蛋白相互作用网络（PPI）图，见图4。将PPI网络导入Cystoscape 3.8.0中，通过NetworkAnalyzer工具进行拓扑分析，通过degree排序，共筛选出个64关键靶点，将前20个靶点使用R4.0.3绘图，见图5。

图4 关键靶点 PPI 网络

图5 关键靶点信息条形图

2.6.4 成分-疾病-靶点网络构建 以纳入的成分、治疗疾病及作用靶点为基础，通过cytoscape 3.8.0构建了成分-疾病-靶点网络图，见图6。

图6 成分-疾病-靶点网络

2.6.5 GO富集分析 将药物疾病共有靶点进行GO的生物过程、分子功能、细胞组分富集，引用String数据库，以P＜0.05为筛选条件，共富集到2270条生物过程，141项分子功能相关，55项细胞组成相关，见图7。

图7 关键靶点基因生物功能注释信息图

2.6.6 KEGG富集分析 将药物疾病共有靶点进行KEGG通路富集分析，引用String数据库，以 P＜0.05为筛选条件，共富集到162条信号通路，见图8。

图8 关键靶点KEGG通路富集分析

2.6.7 成分-疾病-通路-靶点网络构建 将成分-疾病-通路-靶点网络文件导入Cytoscape 3.8.0进行通路网络图的绘制，更直观地展示中药活性成分在治疗DVT中的多成分-多靶点的作用特点。

3 讨论

本研究纳入近年治疗DVT的方剂106首，包括120味中药，其中使用频次≥30的有14味。中药治疗DVT多以活血化瘀、清热利湿为主，辅以补血活血、补气益气及清热凉血。核心药对为“当归-黄芪-红花”。当归功擅补血活血，为养血之要药，黄芪甘温补气，使气血充足、血行通畅，红花有活血祛瘀之功。三者合用通中有补，温凉并济，攻补兼顾，具有活血祛瘀生新之功效，使营卫恢复周流无阻，与DVT形成的基本病机相吻合。

图9 成分-疾病-通路-靶点网络图

以“当归-黄芪-红花”药对作为研究对象，运用网络药理学，通过TCMSP、Geencards、NCBI、OMIM、String等数据库结合Cytoscape 软件挖掘核心药对配伍治疗DVT的内在机制。得到核心药对与疾病前十位共同靶点分别是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT1）、白蛋白（ALB）、白介素6（IL-6）、半胱氨酸肽酶（CASP3）、宿主的原癌基因（JUN）、白介素1β（IL-1β）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）、诱导线粒体蛋白抗体（MYC）、缺氧诱导因子1α（HIF1A）、人表皮生长因子受体（EGFR）。研究表明，AKT1通过磷酸化底物蛋白激活下游信号级联反应，参与调控多个相关基因家族转录，影响细胞生长、存活、增殖、基因转录、蛋白合成、细胞迁移运动等[10]。IL-6能激活血小板，增加其促凝活性，促进血栓的形成[11]。核心药对治疗DVT的主要活性成分为：槲皮素、木犀草素、山奈酚等。槲皮素是一种多醇羟基黄酮类化合物，有文献报道其能抑制血小板聚集及血小板致密颗粒胞吐作用，降低血液的黏滞程度，延迟血栓的形成[12]。木犀草素是一种天然的黄酮类化合物，可通过提高凝血活性物质的含量，促进凝血因子的基因表达量，提高凝血因子的含量，抑制纤维酶原的激活和增加血液的黏度等多方面的综合作用维持机体血液循环功能的稳定[13]。山奈酚是一种黄酮类化合物。山奈酚能抑制纤维蛋白聚合物的形成，减弱凝血酶刺激血小板中细胞外信号调节激酶1/2等酶的磷酸化，延迟凝血时间[14]。这3种有效成分在成分-疾病-靶点网络中作用的靶点多，度值较高，具有抗凝、抗炎、溶栓的药理作用。GO富集分析结果显示，核心药对治疗DVT的生物过程有氧化应激反应、细胞对化学应激的反应、细胞对氧化应激的反应等；其分子功能参与了DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合及泛素样蛋白连接酶结合等。

综上，槲皮素、木犀草素和山奈酚等为治疗DVT的重要有效成分，可通过作用于AKT1、ALB、IL-6等关键靶点和参与PI3K-Akt信号通路、AGERAGE 信号通路、IL-17信号通路等通路等达到治疗DVT的作用。本文运用数据挖掘及网络药理学方法为临床治疗DVT提供可借鉴的中药配伍，阐明核心药物的作用机制，为下一步实验研究奠定理论基础。