免疫诱抗剂对浙贝母生长与抗病的影响

陈敏洁，杨超超，汪晓菲，阮松林，范慧艳*

(1.浙江中医药大学 药学院，浙江 杭州 310053；2.杭州市农业科学研究院，浙江 杭州 310024)

植物在一定的外来物质刺激下，能够对随后的病原菌侵染(包括局部侵染和系统侵染)产生抗性，称为植物的诱导抗病性，又称系统获得抗性或植物免疫[1-2]。该特性充分利用了植物自身对病害发生的潜在控制能力，通过调节植物防卫、代谢系统，诱导产生基础免疫反应，延迟或减轻病害的发生和发展[3]。这种给植物带来刺激的外源生物或分子称为植物免疫诱抗剂，是一种新型生物农药，具有量少而效优、环境相容性好的特点，给环境保护与作物增产带来良好的影响。

诱抗剂可分为生物来源与非生物来源两大类，非生物来源的诱抗剂包括无机盐、有机酸、寡糖类、寡核苷酸、小分子多肽和免疫蛋白等。对于寡糖类植物免疫诱抗剂的开发，该类激发子多来源于动物、植物、微生物的外壳或细胞壁，在自然界含量极为丰富。目前鉴定到的寡糖类激发子主要有胞外多糖、几丁质、壳寡糖、木葡聚糖、海藻糖、海带多糖等[4-6]。壳寡糖是几丁质脱乙酰基后，经酸解或酶解得到的可溶性碱性寡糖。经研究发现，壳寡糖诱导植物抗病时的重要诱抗信号分子，能够诱导柑橘果实[7]、灰霉孢子[8]活性氧的产生，抵御病原菌的入侵；可以促使棉花[9]、草莓[10]细胞活性氧代谢发生改变，显著诱导早期活性氧的迸发；特定壳寡糖浓度处理烟草细胞，可以启动茉莉酸合成途径，使植物开启抗性防御反应[11]；通过一氧化氮合酶(NOS)催化合成NO，Ca2+参与并调节该过程，进而影响烟草细胞相关抗性基因表达[12]。2013年杭州市农业科学研究院研制出3%壳寡糖水剂型的高效广谱免疫诱抗剂保康灵1号(BKL1)，该制剂对葡萄、草莓、鲜食糯玉米等植物的生长与抗病均有良好效果[13-16]。

浙贝母是浙江省的道地药材之一，由于浙江省夏季高温多雨，浙贝母栽培病害较重。灰霉病、黑斑病等是浙贝母的常见病害[17]，生产上常使用化学农药来防控，导致浙贝母鳞茎农药残留及环境污染问题日益严重。本研究开展了植物免疫诱抗剂BKL1在浙贝母生产上的田间应用试验，探讨植物免疫诱抗剂对浙贝母农艺性状、产量和抗病性的影响，旨在为浙贝母种植中农药减量增效技术的探索提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本试验以狭叶型浙贝母为试验材料，于2020年11月4日在浙江中医药大学富春校区中药材种苗繁育基地进行种植，选用大小均匀的浙贝母鳞茎作为种茎，种植小区面积约15 m2(一畦宽1 m，长15 m)，种植密度为20 cm×20 cm，每小区种植300株左右，3次重复。根据试验田土壤地力水平较低的情况，施用50～70 t·hm-2有机肥作为基肥，其他种植技术参考道地药材浙贝母的一般标准种植技术[18-19]。

1.2 处理设计

处理1，CK(清水对照)；处理2，BKL1水剂100倍液；处理3，BKL1水剂200倍液；处理4，BKL1水剂300倍液；处理5，BKL1水剂400倍液；处理6，BKL1水剂500倍液。分别于2021年3月9日、3月23日、4月7日、4月21日共喷施4次不同浓度的BKL1，每个处理重复3次。每次喷施后1周进行采样以及测定。

每次采样时随机挑选各组10株浙贝母，分别取每株浙贝母的上中下叶各3片。选择浙贝母健康植株中完整无损、长势优良的具代表性植株30株测定测定株高、茎粗、鳞茎体积等。

1.3 指标测定

1.3.1 SPAD测定

在药剂喷施处理后1周，用SPAD-502-日本柯尼卡美能达手持式叶绿素测定仪测量叶片SPAD。对所有处理组进行随机抽样，每个处理组测量10株，每株随机选取上、中、下层健壮无病虫害的叶片(均在离叶尖1/3处测定)，每层测定3次，记录数据，并取平均值。

1.3.2 苯丙氨酸解氨酶活性测定

参照苯丙氨酸解氨酶(PAL)测定试剂盒说明书提取粗酶液，在290 nm波长下用Bio Tek多功能酶标仪测定吸光度，计算苯丙氨酸解氨酶活性。

1.3.3 农艺性状以及产量、体积测定

药剂处理喷施3次后，选择浙贝母健康植株中完整无损、长势优良的具代表性植株30株，测定株高、茎粗。倒苗后，收获浙贝母的鳞茎，从每个处理组取具代表性鳞茎50个，洗净后擦干，测量鲜重；测量鳞茎体积时，取适宜体积烧杯(最小刻度精确至0.1 mL)，倒入适量水至整数刻度，读数并记录，放入适量需测量的鳞茎，确保液面在烧杯刻度范围，待液面稳定后，读数并记录。两次体积差即为所测浙贝母鳞茎的体积。

1.4 数据处理

采用SPSS 25.0软件进行数据分析，Origin 2022软件和Excel 2019软件进行数据处理作图。

2 结果与分析

2.1 农艺性状

由表1可知，与CK组相比，不同浓度BKL1处理的浙贝母株高和茎粗差异不明显，茎粗范围在3.41～4.14 cm。从效果综合来看，300倍液BKL1处理组农艺性状表现最好，说明BKL1在适宜浓度能促进浙贝母植株生长(抗倒伏)。

表1 不同浓度BKL1处理对浙贝母农艺性状的影响

2.2 叶片SPAD

由图1可知，与CK相比，BKL1处理组中100倍液、200倍液和300倍液的浙贝母叶片SPAD在喷施第2次和第3次后整体升高，且随BKL1浓度下降呈整体阶梯状上升。从效果来看，药剂处理喷施2次时，浙贝母处在生长旺盛期(3月下旬至4月上旬)，叶片SPAD整体较高；药剂处理喷施3次及以后，叶片SPAD阶梯状趋势仍旧存在，由于处于倒伏期，光合作用下降，使栽培浙贝母整体SPAD下降。在浙贝母生长旺盛期，200～300倍液BKL1处理组效果最明显，与CK相比分别增加55.8%～88.1%，说明BKL1在适宜浓度能促进浙贝母叶片叶色值的增加，加强光合作用。

图1 BKL1处理对浙贝母叶片SPAD的影响

2.3 发病率和PAL活性

PAL的活性与植物抗病性呈正相关[20-21]。通过对浙贝母叶片PAL活性检测(图2)可知，与CK相比，BKL1处理中100倍液、200倍液、300倍液、400倍液组的PAL活性均有增长，其中300倍液BKL1处理组PAL活性最高。说明BKL1在适宜浓度能显著提升PAL活性，增强浙贝母植株抗病性。灰霉病、黑斑病是浙贝母的主要田间病害。从定植开始到收获期，统计种植区浙贝母发病情况，每个处理组按300株计算。结果发现，不同处理后浙贝母的病害发生率不同，经BKL1处理的植株发病率明显减少，400倍液BKL1处理组浙贝母植株发病率最少，为10.7%。

2.4 产量

由表2可知，与CK相比，BKL1处理组中浙贝母鳞茎产量都有明显提高，300倍液、400倍液和500倍液BKL1处理组中浙贝母鳞茎产量显著提高，其中300倍液BKL1处理组鳞茎产量相对增长87.3%；与CK相比，浙贝母平均鳞茎体积也有显著提高，其中300倍液BKL1处理组浙贝母平均鳞茎体积相对增长43.3%，说明适宜浓度BKL1可通过增加浙贝母鳞茎的体积来提高浙贝母产量。

3 小结与讨论

植物免疫诱抗剂是植物免疫工程技术出现的新领域，是当前环境保护、生物农药等方向的研究热点，具有巨大的发展前景，它的应用使植物病虫害的绿色防控有了新的突破，是有害生物绿色防控的新技术和新方法，是保障农产品安全、减少环境污染、实现农药零增长的有效途径[22]。本研究供试BKL1是利用3%壳寡糖研制而成的一种高效广谱的植物免疫诱抗剂。研究表明，适宜浓度BKL1处理能促进浙贝母光合作用，提高叶片SPAD、增强PAL活性、优化浙贝母农学性状、提高产量。综合来看，200～400倍液BKL1处理效果较好，能够一定程度上激活浙贝母的免疫系统，增强浙贝母抗病能力，促进浙贝母增产和品质改善。

浙贝母是传统“浙八味”药材之一，它的生长期是当年9月份至次年5月份，从种植至采收一直处于气温比较低的阶段，虫害相对而言不是特别严重，而病害的发生比较普遍。作为历史上的传统产区，浙贝母在浙江地区被广泛栽培，部分中药材生产基地由于多年连续种植浙贝母，常见病害加重，最终导致产量严重下降，而部分药农盲目使用杀菌剂更是不利于可持续发展。在感病季节，连茬、种植密度、地势等因素都会造成病害出现甚至群体暴发，需要科学合理地防控病害，来保证浙贝母入药部位的产量和质量，实现效益化可持续发展。目前，政府利用增施有机肥、测土配方施肥等途径推广农药技术，研究从施肥、大棚栽培、种植密度、轮套种、病害防治和繁殖方式等角度来探究提高浙贝母产量的有效途径[23]。如何应用浙贝母种植过程中农药的减量增效技术以及达到高产优质浙贝母鳞茎生产计划是本研究的目标，而免疫诱抗剂通过提高植物免疫诱抗性，能从根本上减少或避免农药的使用。本试验供试的BKL1不仅提高植物自身抗病能力，促进植物生长，还能提高药材安全性和产量，为浙贝母的绿色种植提供保障。