桔梗皂苷D经CYP的代谢活化在抑制A549细胞活性中的作用研究

宋丹妮,陈苏勤,管文燕,周徐陈,张正光,郭园园

(1. 南京医科大学护理学院,江苏 南京 211100；2. 南京鼓楼医院,江苏 南京 210008；3. 南京中医药大学医学院·整合医学学院,江苏 南京 210023)

据GLOBOCAN统计, 2018年约有209万肺癌新病例和176万死亡病例,分别占癌症病例总数的11.6 %和癌症死亡总数的18.4 %[1]。在肺癌多种治疗手段中,中药治疗已成为我国治疗肺癌的特色，中药成分在体内的代谢与激活机制逐步引起重视[2]。桔梗皂苷D是从桔梗中分离得到的一种三萜化合物,其具有润肺、化痰、排脓的功效，是桔梗中最重要的抗肿瘤成分。桔梗皂苷D作为一种潜在的抗肿瘤药物，其在机体内的生物转化与代谢效应尚缺乏研究。细胞色素P450酶(CYP450s)作为I相反应代谢酶，是关键的药代动力学因素之一[3]。CYP450s中CYP1A1、1A2、2B6、2E1在肺癌组织中含量丰富，在肺癌的发生发展与抗肺癌药物的代谢作用中起着重要作用[4-7]，其对桔梗皂苷D的代谢及作用的影响尚不明确，因此本研究进行了相关探讨，旨在为桔梗皂苷D作为肺癌的靶向治疗药物提供实验依据。

1 实验材料与方法

1.1细胞、质粒以及细菌 人非小细胞肺癌细胞株(A549细胞)、用于慢病毒包装的293T细胞株由实验室保存。pCDH-CYP1A1、CYP1A2、CYP2B6、CYP2E1质粒及包装质粒pMD2、psPAX、载体质粒pCDH均购自擎科生物科技有限公司。

1.2试剂 桔梗皂苷D购自上海源叶生物科技有限公司；DMEM细胞培养基、胎牛血清(FBS)购自GIBCO公司；增强化学发光(ECL)试剂盒购自Amersham Bioscience公司；一抗CYP1A1、CYP1A2、CYP2B6、CYP2E1购自Millipore公司；二抗兔抗羊抗体购自KPL公司；转染试剂(Lipofectamine 2000 Transfection Reagent)购自Invitrogen公司；甲醇购自Merck(Darmstadt,Germany)。

1.3仪器 VS-1300L细胞培养超净台购自美国AIR TECH公司；BioPhotometer plus核酸蛋白测定仪购自德国Eppendorf公司；Model 680型酶标仪购自美国Bio-Rad公司；Fresco21高速低温离心机购自德国Electron公司；RS-232型CO2恒温培养箱购自德国HERA CELL公司；125-BR垂直电泳仪购自美国Bio-Rad公司；LC-MS/MS TSQ8000购自美国Thermo Fisher公司。

1.4慢病毒载体构建 A549细胞、293T细胞培养于DMEM完全培养液中,在37 ℃的5% CO2细胞培养箱中培养。取对数生长期的293T细胞消化传代至培养皿中,继续培养使其生长到80%的融合度，将3 μg pMD2、6 μg psPAX 和7.5 μg载体质粒加到150 μL OPTI-MEM内混匀；取25 μL Lipofectamine 2000加入到500 μL OPTI-MEM内混匀,室温静置 5 min,将质粒混合物加入Lipofectamine 2000,混匀后室温静置15 min,逐滴加入到培养皿内,充分混匀。6 h后更换为含10% FBS的DMEM新鲜培养液。

1.5稳定表达CYP450s的A549细胞株的制备 当A549细胞达到80%～90%的融合度时,将收集到的病毒液加入培养皿中，每隔24 h重复感染1次,共感染3次。经过嘌呤霉素筛选出纯化的细胞系,用蛋白和mRNA表达水平鉴别细胞模型是否构建成功。

1.5.1蛋白表达检测方法 采用Western blot法检测：取细胞，用磷酸盐缓冲液洗涤2次,加入Tris裂解液,裂解细胞1 min后,超声进一步破解。离心后取上清,-20 ℃保存，用BCA法测定蛋白含量。进行SDS-PAGE凝胶电泳及转膜后，将膜转移到封闭液中，1 h后加入一抗,4 ℃孵育过夜,用1×TBST洗膜5次(每次5 min)。加入对应二抗室温孵育1～2 h,1×TBST洗膜3次(每次10 min)。现配发光液,进行曝光及拍照。

1.5.2mRNA表达检测方法 采用PCR法检测：Trizol Reagent提取RNA,反转录成cDNA,并以其为模板,进行PCR扩增(引物序列见表1)。PCR扩增程序:95 ℃预变性5 min,94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1.5 min，变性退火及延伸进行40个循环,72 ℃延伸10 min。以GAPDH作为内参基因,采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

表1 CYP450s扩增引物序列及产物长度

1.6检测指标与方法

1.6.1细胞活性实验 在96孔板中加入A549细胞,放入37℃、5% CO2培养箱中培养24 h，取稳定表达CYP1A1、CYP1A2、CYP2B6、CYP2E1的细胞系，并设置空载对照组。待细胞融合度达到70%～80%时,与含不同浓度的(0，1，2，4 μmol/L)桔梗皂苷D孵育24 h后,每个孔加入10 μL CCK-8溶液,并置于培养箱中1 h,使用酶标仪测定450 nm波长处的吸光度(OD)。

1.6.2体外代谢实验 分别用CYP1A1、CYP1A2、CYP2B6、CYP2E1 P450重组酶在体外进行代谢,设置CYP1A1组、CYP1A2组、CYP2B6组、CYP2E1组。孵育体系：终浓度为0.06 mg/mL桔梗皂苷D,终浓度为0.06 mg/mL重组酶,终浓度为50 mmol/L TrisHCl(pH 7.4),终浓度为5 mmol/L MgCl2,终浓度为1 mmol/L EDTA,加入NADPH启动反应并继续37 ℃孵育, 直接甲醇终止反应为作用0 min,经过120 min孵育后加入甲醇终止反应为作用120 min，计算各组作用0 min和120 min时桔梗皂苷D的含量。超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS)条件:检测波长260 nm；色谱柱:Welchrom-C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm,Welch Material,Inc,ΜSA)；以水和甲醇为流动相,流速为0.3 mL/min,进样量为2 μL,柱温25 ℃,10%甲醇(0～15 min)。质谱条件:喷雾电压3 200 V，鞘气流速50 Bar，辅助气流速15 Bar，毛细管温度350 ℃，分辨率70 000,ESI负离子检测。桔梗皂苷D分子式:C57H92O28,[M-H]-:1223.5686。

1.6.3分子对接模型预测 使用分子对接模型预测桔梗皂苷D与CYP450s的结合位点和结合力。利用PDB(https://www.rcsb.org/)蛋白数据库下获得CYP450s的蛋白受体的晶体结构文件,将桔梗皂苷D的SMILES字符串转换为3D结构文件。使用Autodock4对桔梗皂苷D及CYP450s蛋白进行处理,运行Vina进行分子对接,使用PyMOL将对接结果进行可视化展示。

1.7统计学方法 采用Graphpadprism 9软件进行统计学分析和绘图，组间差异比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1稳定表达CYP450s细胞株的建立与鉴定 高表达CYP450s的A549细胞系蛋白表达检测结果显示，A549-CYP1A1、CYP1A2、CYP2B6、CYP2E1中的代谢酶表达水平与各空载对照组相比明显升高,见图1；高表达CYP450s的A549细胞系mRNA表达检测结果显示,表达CYP450酶的细胞系出现特征条带,空载对照组未出现，见图2。

注：A549为空载细胞；A-1A1为稳定表达CYP1A1的A549细胞系；A-1A2为稳定表达CYP1A2的A549细胞系； A-2B6为稳定表达CYP2B6的A549细胞系；A-2E1为稳定表达CYP2E1的A549细胞系

注：A549为空载细胞；A-1A1为稳定表达CYP1A1的A549细胞系；A-1A2为稳定表达CYP1A2的A549细胞系； A-2B6为稳定表达CYP2B6的A549细胞系；A-2E1为稳定表达CYP2E1的A549细胞系；M1为D15000 Marker；M为D2000 Marker

2.2桔梗皂苷D对A549-CYP450s细胞系活性的影响 与CYP1A2组、CYP2B6组、CYP2E1组相比，CYP1A1组细胞活性随桔梗皂苷D浓度的增加而降低(P均<0.05)。见图3。

图3 不同浓度桔梗皂苷D对A549-CYP450s细胞系活性的影响

2.3CYP1A1、CYP1A2、CYP2B6、CYP2E1对桔梗皂苷D的代谢作用 与作用0 min相比,CYP1A1组作用120 min时桔梗皂苷D的含量显著降低(P<0.05),CYP1A2组、CYP2B6组、CYP2E1组作用120 min时桔梗皂苷D含量与作用0 min时比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图4。

图4 A549细胞中 CYP1A1、CYP1A2、CYP2B6、CYP2E1作用0 min和120 min对桔梗皂苷D的代谢效应

2.4分子对接情况 桔梗皂苷D中23-C原子上的-OH与靶点活性位点铁卟啉中心铁离子形成稳定的螯合键，桔梗皂苷D与CYP1A1之间的主要作用力是氢键与疏水相互作用，其中桔梗皂苷D与氨基酸残基F384、S230、T497、K499、D320、F224、N222分别形成氢键，与氨基酸残基I386、L496、F112、F123、V218、G229、V228、Y494、I493形成疏水相互作用。相互作用模式见图5。

图5 桔梗皂苷D与CYP450s的分子对接模型

3 讨 论

目前肺癌是癌症患者死亡的主要原因,肺癌患者5年相对生存率平均为19%[8]。外科手术切除通常仅适用于早期肺癌的治疗,晚期肺癌的治疗策略包括手术切除、放疗、细胞毒性化学疗法以及光动力疗法。尽管化学疗法和放射疗法的结合可以提高生存率,但大多数患者死于疾病进展期,通常由于对化学治疗药物的获得性或固有耐药性引起[9]。因此,抗癌药物的开发与作用机制、生物转化等方面的研究是确保药物安全使用的前提，也是当今研究的热点。

天然草药包含各种酚类化合物、维生素、类胡萝卜素和类黄酮,具有抗氧化、抗过敏、抗癌等各种药理作用。作为著名药用植物,桔梗中的桔梗皂苷D被发现可以通过多途径对多种肿瘤细胞的增殖具有抑制作用[10]。Li等[14]研究证实,桔梗皂苷D可以通过破坏热休克蛋白90/细胞分裂周期蛋白37复合物(Hsp90/Cdc37)的相互作用,反馈阻断终止mTOR抑制诱导的存活信号而发挥抗癌作用。Zhao等[15]发现桔梗皂苷D可通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路、激活JNK和p38 MAPK信号通路,诱导肺癌细胞自噬。Han等[16]和Huang等[17]报道桔梗皂苷D可触发肺癌细胞中程序性死亡配体1(PD-L1)的细胞外释放，减少癌细胞表面PD-L1表达，促进IL-2分泌和T细胞活化，恢复抗肿瘤免疫反应。Park等[18]报道桔梗皂苷D可直接发挥细胞毒性作用,促进肿瘤细胞凋亡和免疫刺激作用,控制癌症相关恶病质。

CYP450s是一类血红蛋白耦联单加氧酶，在药物生物转化、外源性物质的解毒、细胞代谢和体内平衡中起着关键作用，是类固醇、脂溶性维生素、致癌物及药物等物质代谢的重要酶，其中CYP1、CYP2、CYP3 和 CYP4族主要参与药物的代谢。许多中草药及其活性成分可以通过CYP450s和转运蛋白的影响，从而导致药理作用增强或减弱。因此，明确代谢酶与中药代谢之间的相互作用，对于明确药物在生物体内的吸收、分布、活化、代谢和排泄过程有重要意义。

CYP1A1是CYP450s的主要代谢酶之一，主要存在于气管、肺等呼吸系统组织，代谢包括脂肪酸花生四烯酸、氟喹诺酮类抗生素双氟沙星和药物茶碱等底物[19]。在中药方面，CYP1A1可代谢吴茱萸碱、脱氢吴茱萸碱和芸香碱等传统上用于治疗高血压和胃肠道疾病的药物[20]。尽管大多数研究集中在CYP1A1的致癌作用上，但越来越多的研究表明这种酶在抗癌药物的代谢中也起着重要作用。 Wilsher等[21]和Ren等[22]报道，在CYP1A1的作用下黄酮醇高良姜素(3’,5,7三羟基黄酮) 被羟基化和去甲基化，产生代谢物山柰酚，山柰酚是一种抗非小细胞肺癌的黄酮类化合物。

为了探究肺癌细胞中桔梗皂苷D的主要代谢酶,本实验选择人肺癌细胞系A549进行研究。首先通过分子生物学手段稳定转染CYP代谢酶基因建立细胞模型,并通过蛋白和mRNA检测证明该细胞系的成功构建。鉴于细胞活性与肿瘤的发展密切相关,细胞活性的改变可以直接反映细胞损伤状态,影响肿瘤抑制基因的失衡，故使用CCK-8试验初步评估桔梗皂苷D在CYP代谢酶激活后对A549细胞活性的影响，并通过体外孵育实验筛选出桔梗皂苷D在呼吸系统的主要代谢酶。结果显示桔梗皂苷D经CYP1A1代谢活化抑制了A549细胞活性,CYP1A1是A549细胞中的桔梗皂苷D主要代谢酶,桔梗皂苷D经CYP1A1代谢活化增强了对肺癌细胞活性的抑制作用。另外分子对接模型预测提示桔梗皂苷D与CYP1A1有较强的结合力。

综上所述，桔梗皂苷D在肺癌细胞中经CYP1A1可以有效活化代谢,对肺癌细胞有明显抑制作用，本研究结果为CYP1A1基因功能的丰富及桔梗皂苷D在肺癌治疗作用方面的合理应用和临床药理研究提供了理论依据。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。