大口黑鲈源杀鱼爱德华氏菌的鉴定及组织病理学观察

■ 王凯 阮鹏飞（ 江门市澳保生物科技有限公司 ； 江门市动物疫病预防控制中心 ）

图1 患病大口黑鲈体表病症

图2 患病大口黑鲈内脏解剖图（a、头肾；b、后肾；c、心脏；d、肝脏；e、脾脏；f、果冻状黄色腹水）

大口黑鲈（Micropterus salmoide），俗称加州鲈。属于鲈形目、鲈亚目、太阳鱼科，是一种纯淡水的广温性肉食性鱼类。原产于北美洲的淡水水域，后引入英国、法国、西非、巴西、菲律宾等国及我国香港、台湾等地区养殖，其养殖水域几乎遍布全球。20世纪80年代初引入我国内地，现已推广到全国许多省市，成为我国特种水产品之一。近年来，由于养殖密度的不断扩大，病害问题不断增多，其中，作为引起人类感染的重要人畜共患病原微生物，爱德华氏菌是鱼类中最重要的细菌性疾病之一，困扰着全球水产养殖业，在淡水鱼类养殖中引起败血症和巨大的经济损失。

爱德华氏菌属肠杆菌科，2012年以前，世界公认的爱德华氏菌属分为三个种，包括迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda, E.tarda）、保科爱德华氏菌（EdwardsiellaHoshinae, E.hoshinae）和鮰爱德华氏菌（Edwardsiella ictalurid, E.ictaluri），其中，分布和宿主范围较广的是迟缓爱德华氏菌，由于迟缓爱德华氏菌的不同来源的分离株在表型和遗传特征方面存在着很多的差异，自2013年Abayneh等人的研究将异于迟缓爱德华氏菌的分离株重新命名为杀鱼爱德华氏菌（Edwardsiella piscicida），杀鱼爱德华氏菌呈全球性地理分布，宿主范围也十分广泛，多为海水和咸淡水鱼类，包括加州鲈、尖吻鲈、白鲑鱼、欧洲鳗鲡、真鲷、斑点叉尾鮰、大菱鲆和黑斑刺魟等，给相关养殖产业造成了巨大的经济损失。因此，通过对该属细菌的研究，优化诊断方法，提升防控效率，对水产养殖业有着十分重要的意义。

本研究以广东省佛山市杏坛镇区域养殖塘发病大口黑鲈的细菌性病原体为研究对象。通过对菌株进行分离纯化，观察形态；将分离纯化的菌株进行菌种鉴定；以及制作组织印片，观察各组织中细菌的形态及分布情况；通过组织切片，观察各组织的病变；结合药敏实验结果，记录病原菌对各种抗生素的敏感性。文中描述了大口黑鲈感染爱德华氏菌后引起的症状，为大口黑鲈养殖业提供更多的病害预防及诊断思路；通过分析药敏实验结果，初步判断爱德华氏菌的敏感抗生素药物，为大口黑鲈养殖业提供更多的病害防控策略，本文中的药敏实验结果仅对本次采样的大口黑鲈病鱼，针对不同的塘养殖的大口黑鲈感染爱德华氏菌后，应再次进行药敏实验，分析敏感药物。

1 材料与方法

1.1 实验材料

脑心浸出液培养基（BHI）和革兰氏染色液购自环凯微生物，药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司，超白吸附载玻片和盖玻片购自江苏世泰实验器材有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品采集和病原分离及鉴定

2021年11～12月，对广东省佛山市杏坛镇区域养殖塘大口黑鲈自然发病病样进行多次采样，对发病情况、病理特征等进行检测。采用平板划线法，在BHI 固体培养基上对濒死的患病大口黑鲈的后肾、脾脏和皮下脓肿等进行接种培养，置于28℃生化培养箱中过夜培养。选择呈优势生长的单菌落，在BHI 固体培养基上进行纯化分离，从而得到单菌落，挑取单菌落进行革兰氏染色。将纯化分离的含有单菌落的平板送至鉴定公司进行菌种鉴定。

将菌株的16s rDNA基因扩增序列通过NCBI（National Center for Biotechnology Information）进行同源性分析，选取相关性较高的16s rDNA序列使用Clustal W进行多序列比对分析，使用MEGA5.0软件中的邻接法（Neighbor Joining method）构建系统发育树。

1.2.2 组织印片

对采集样品的肝脏、脾脏、肾脏和血液进行涂片，干燥后进行瑞氏-吉姆萨染色，在载玻片上均匀滴加瑞氏染液1mL，染色1min，然后在瑞氏染色液中均匀滴加吉姆萨染色液3mL，染色20min。染色完成后，用蒸馏水将染色液冲洗干净，继续冲洗至染色区域为淡紫色，注意不要直接冲洗染色部分，干燥后在100倍油镜下观察细菌形态。

1.2.3 组织切片

将病鱼的心脏、肝脏、脾脏和肾脏组织切块使用4%多聚甲醛溶液进行固定，固定1h后更换一次4%多聚甲醛溶液，寄出进行组织切片制作。

1.2.4 药敏实验

挑选分离纯化的单菌落置于BHI液体培养基中进行扩培，28℃下摇床培养24h，吸取100μl菌液滴加在BHI固体培养基上，均匀涂布，将药敏片贴于培养基上，放入28℃培养箱中培养24h，观察测量抑菌圈大小并判定结果。

1.2.5 人工回感实验

随机采取 3尾购自广东佛山某水产养殖场的健康大口黑鲈，取其内脏组织进行研磨，在BHI平板上进行涂布，培养24h后无优势菌生长。再购12尾大口黑鲈暂养3d后进行人工感染实验，人工感染实验分为两组，实验组：取已确定健康无病的加州鲈6尾，使用无菌水将本文分离的菌种浓度调整成106，每尾鱼注射0.5mL的菌液。对照组：取同样的6尾鱼，每尾鱼注射等量的无菌水，感染期间每天记录各组鱼的症状及死亡情况，并对濒死的鱼进行解剖观察和分离细菌。

2 结果

2.1 发病病例临床症状

发病大口黑鲈主要为1龄大口黑鲈，观察病鱼体表，发现体表血点，烂鳃，眼球突出，黄身，解剖后可见果冻状或血样腹水，心脏糜烂，心膜炎，尾柄皮下脓肿，头肾、后肾肿大，空胃，脾脏肿大充血，脾脏大量白点，肝脏肿大，豆腐肝的症状。

2.2 细菌分离及鉴定

通过平板划线对病鱼组织中的细菌进行粗分，28℃培养24h后，平板上长出优势菌，将优势菌划线，进行纯化分离，置于28℃培养24h后，获得单一菌种，菌种在BHI培养基上形成的菌落特征为圆形不透明、淡黄色、表面湿润光滑、边缘整齐（图3，b），革兰氏染色结果系显示该菌为革兰氏阴性菌（图3，c）。将单一菌种平板寄出进行鉴定，进行16s rDNA测序，将测序所得序列在NCBI数据库上进行比对，比对结果该菌与杀鱼爱德华氏菌一致性达99.19%，并将该菌株命名为PB-025。

图3 菌株的生长情况和染色形态（a、后肾及脾脏菌种粗分离；b、纯化后菌落的生长形态；c、菌种革兰氏染色呈阴性[红色]）

利用MEGA5.0软件采用邻接法（Neighbor Joining method）构建的系统发育树结果显示（图4），菌株PB-025与杀鱼爱德华氏菌（Edwardella piscicida）聚为一支。

图4 基于菌株PB-025 16s rDNA序列的系统发育树

图5 爱德华氏菌在各组织中的分布(a、肝脏中的爱德华氏菌；b、脾脏中的爱德华氏菌；c、肾脏中的爱德华氏菌；d、血液中的爱德华氏菌；标尺为20μm)

2.3 组织印片

对患病大口黑鲈的肝脏、脾脏、肾脏和血液进行瑞氏-吉姆萨染色，染色后能够很好的观察到各组织中的杀鱼爱德华氏菌的分布情况，可见在肝脏、脾脏、肾脏和血液中均有游离或吞噬的爱德华氏菌，细菌长约3～5μm。

2.4 组织切片

从组织切片结果中可得，在心膜的致密层中明显可见大量的爱德华氏菌（图6，a），且爱德华氏菌感染会引起心膜炎，导致心脏外膜变厚，以及心脏海绵层中会形成肉芽肿结构（图6，b）；脾脏造血区域一直是受影响最严重的组织，脾脏中可见大量的肉芽肿结构（图6，c）；肾脏中包含多灶性到合并的肉芽肿（图6，d）；病变在肝脏中不算严重，但也可见少量的凝固性坏死灶（图6，e）。肉芽肿性炎症、坏死灶和细菌的可变组合是感染爱德华氏菌病样组织中常见的组织病理症状。

图6 自然感染的大口黑鲈中爱德华氏菌相关病变的显微照片(a、b：心脏的病变，a：标尺为20μm，b：标尺为200μm；c：脾脏的病变，标尺为500μm；d：肾脏的病变，标尺为100μm；e：肝脏的病变，标尺为200μm)

2.5 药敏实验

将扩培的爱德华氏菌进行药敏实验，结果如表1所示：PB-025菌株对盐酸多西环素、硫酸新霉素、氟苯尼考、环丙沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、丁胺卡那、诺氟沙星、卡那霉素和四环素呈现高度敏感，对恩诺沙星、头孢拉定、阿奇霉素、链霉素和庆大霉素呈现中度敏感，对阿莫西林和红霉素呈现低度敏感，对复方新诺明和青霉素具有耐药性。该结果与加州鲈迟缓爱德华氏菌的敏感性药物存在一定的一致性。

表1 各药物的抑菌圈信息

2.6 人工回感实验

健康无病的大口黑鲈在感染第5d后开始出现死亡，发病病症与自然发病的鱼存在相似性，18d内累计死亡率为100%，而对照组在实验期间未出现死亡情况（图7），实验结果说明本文分离的菌株PB-025具有较强的致病力。且从人工感染的大口黑鲈组织中再次分离致病菌，菌落形态及革兰氏染色与自然发病的病原菌的一致，结果表明本文从自然发病的大口黑鲈所分离的细菌为此次发病的致病菌。

图7 菌株PB-025的人工感染实验

3 讨论

目前，对于鱼类爱德华氏菌的理化特性、致病机制以及防控手段都有相关研究，其中，防控手段尤为重要，有研究表明可通过免疫预防手段防控爱德华氏菌，抗E.tarda的单抗可以显著提高牙鲆抵抗爱德华氏菌的能力，延长存活时间；有研究研制出迟缓爱德华氏菌的灭活疫苗，能够对大菱鲆爱德华氏菌病起到重要的保护作用，能够有效抵御迟缓爱德华氏菌的强毒株；也有研究研制出针对感染迟缓爱德华氏菌的罗非鱼的菌蜕疫苗，实验结果表明该疫苗有较高的免疫保护率。

由于杀鱼爱德华氏菌是自2013年迟缓爱德华氏菌区别开来，因此对杀鱼爱德华氏菌的相关研究还相对较少，其中，有研究报道了在患病乌鳢中检测到了杀鱼爱德华氏菌，并对该菌株进行了药敏实验，有研究为构建养殖大菱鲆杀鱼爱德华氏菌快速检测模型提供了思路，也有研究报道了斑马鱼和草鱼组蛋白核苷酸的多态性在杀鱼爱德华氏菌感染中的作用，筛选出了能增强鱼类免疫力及对杀鱼爱德华氏菌的抗病力的抗菌组蛋白，同时也有研究构建了杀鱼爱德华氏菌的 Δcrp 疫苗候选株，但仅有这些研究是远远不够的，为了防控杀鱼爱德华氏菌给鱼类带来的危害，减少鱼类养殖过程中的经济损失，应当重视在养殖过程中遇到的杀鱼爱德华氏菌感染。本研究采用的瑞氏-吉姆萨染色法能够快速简便的对杀鱼爱德华氏菌进行初步鉴定，并通过药敏实验进行精准用药获得了成功，本次研究也验证了使用吉姆萨染色剂可以更好地观察细菌的研究。

首先养殖环境的好坏与养殖鱼类的健康息息相关，也是防控爱德华氏菌病的关键因素。关于保持良好的养殖环境有几点建议：1、保持良好的水质，定期使用环境友好的益生菌制剂产品，达到藻相平衡、稳水肥水的效果；2、定期改底净水，达到分解底部残饵粪便及有机污染物，降解毒素，抑制病原菌、寄生虫的滋生，降低养殖环境进一步恶化的风险；3、定期消毒与内服保健，抑制有害菌生长，提高养殖动物自身免疫力的同时促进鱼体伤口恢复；4、根据养殖病害“三环”理论做好全面防御。

同时养殖密度也十分关键，适当的养殖密度、科学饲喂，能明显降低细菌性疾病的发生率。定期拌喂中草药类、维生素类、保肝护肝类、提高免疫力类的产品，可增强体质，提高养殖动物自身免疫力，减少应激；另外要加强管理，在投放鱼苗前做好鱼塘的清塘和消毒工作，并避免混养不同生长阶段的鱼，其次对病原菌的出现进行密切监控也是防控的有效方法。

最后，在鱼类发生细菌性病害时，应针对病症寻找真正原因，做到有效、精准用药。在预防与治疗的同时，避免滥用药物导致环境恶化、病原菌耐药性产生，而给养殖埋下更大的隐患。 （参考文献略）