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16周HIIT干预对增龄大鼠骨骼肌线粒体自噬、ATP浓度及有氧运动能力的影响

2022-12-07蒋中业曹国欢张一民温天皓

中国体育科技 2022年10期
关键词:丙酮酸脱氢酶数目

蒋中业,曹国欢,张一民,倪 震,温天皓,邵 佳,苏 浩

骨骼肌增龄性退变所引起的活动能力受限是导致中老年人群生活质量下降、运动过程中出现异常的重要原因之一。线粒体作为ATP合成的场所,线粒体自噬对维持健康线粒体数目和能量代谢稳态至关重要(李渊芳等,2019)。有研究表明,随着大鼠年龄增长,其机体内线粒体数目较年轻时显著减少(陈彩珍等,1999;何宏文等,1998;Davies et al.,1981)。增龄过程中,线粒体的损伤以及抗氧化能力下降会引起氧自由基的累积从而诱导线粒体自噬的发生(Dadakhujaev et al.,2009)和线粒体功能受损,导致骨骼肌局部能量不足,致使受影响的肌纤维局部萎缩,引起衰老时出现的肌纤维丢失(Lang et al.,2010,1993),进而推进骨骼肌增龄性退变的进程(Fulle et al.,2004,2005)。

BNIP3是存在于哺乳动物细胞内的部分线粒体标记蛋白,在线粒体自噬调节过程中发挥重要作用(Ney,2015)。PI3-k具有丝氨酸/苏氨酸激酶的活性,也具有磷脂酰肌醇激酶的活性。BNIP3和PI3-k为反映线粒体自噬的指标(杨春兰等,2017;Ney,2015),通过其表达量的变化可以有效判断机体线粒体自噬发生的程度。

有研究表明,运动锻炼对大鼠机体内线粒体数目的减少具有良性作用(Schmalbruch,1970)。高强度间歇训练(high-intensity interval training,HIIT)作 为 一 种 短时(Bartlett et al.,2011)、高效(严翊 等,2012)的训练方式,可以有效提升最大摄氧量(maximal oxygen consumption,O2max)(梁春瑜等,2017)和运动能力(崔新雯等,2018;范朋琦等,2018)。虽然当前已有采用HIIT干预骨骼肌增龄性退变的相关研究,且在前期研究中已证实HIIT运动能对大鼠增龄过程中能量代谢相关AMPK和PGC-1α蛋白产生良性影响(蒋中业等,2019),但目前HIIT干预对大鼠增龄过程中线粒体自噬、ATP合成能力和机体有氧运动能力的影响以及上述各指标间的变化关系尚不明确。

本研究通过建立增龄大鼠模型,并对其进行HIIT干预,观察大鼠增龄过程中机体有氧能力、线粒体中ATP浓度和丙酮酸脱氢酶活性、骨骼肌中线粒体数目和自噬体数目、骨骼肌线粒体BNIP3和PI3-k相对表达量的变化规律。探究增龄过程中大鼠线粒体自噬和有氧运动能力的关系及HIIT干预对线粒体自噬和有氧运动能力的作用效果。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象及分组

本研究选取8月龄SPF级雄性Wistar大鼠40只(北京维通利华实验动物技术有限公司),按照随机数字表将大鼠随机分为安静对照组(C,n=20,平均体质量为602.78 g)和HIIT干预组(H,n=20,平均体质量为585.86 g)。

1.2 实验方案

1.2.2 运动训练方案

所有大鼠进入动物房后进行为期1周的适应性喂养,各组运动干预方案为:C组不进行运动;H组根据O2max测试结果重新调整运动强度。根据大鼠达到O2max时的跑台运动速度确定HIIT运动方案进行为期16周的训练,每天训练50 min,每周训练5天。每天的训练内容参照王林佳等(2016)的HIIT训练方案进行改良(表1)。

表1 HIIT组训练方案Table 1 The Training Program of HIIT

1.3 取材

称量大鼠体质量后采用2%戊巴比妥钠(剂量为0.25~0.50 g/kg)腹腔注射麻醉大鼠,随后固定其四肢及头部,取部分新鲜比目鱼肌进行线粒体提取后用于ATP浓度和丙酮酸脱氢酶活性测试。取部分比目鱼肌样品置于包埋剂中保存,用于电镜拍摄。剩余比目鱼肌用锡箔纸包好后投入液氮中速冻,随后转入-80℃冰箱中保存,用于BNIP3和PI3-k的Western blot测试。

1.4 指标测试方法

1.4.1 骨骼肌线粒体透射电镜拍摄

取新鲜大鼠比目鱼肌10 mg,2.5%戊二醛于4℃环境下固定2 h。使用磷酸缓冲液冲洗(pH 7.2)3次,每次10 min。随后采用1%的锇酸在4℃环境下进行2 h的固定后使用双蒸水冲洗3次(每次10 min),再使用梯度酒精脱水,50%、70%、90%的酒精浓度各进行10 min,100%浓度进行2次,每次15 min。随后分别使用环氧丙烷进行2次、每次各15 min的操作(环氧丙烷:树脂以1∶1和1∶4的比例于室温环境下分别置换1 h)。再使用纯树脂于室温条件下浸透2 h后使用纯树脂进行包埋(EPON 812),于45℃、60℃、80℃环境下进行持续5 h的样品聚合。聚合成功后对其进行半薄切片(使用天青-美兰染色后光镜下定位观察)和超薄切片(使用醋酸双氧铀、枸橼酸铅进行染色)。使用JEM-1400电镜,在2 000倍下观察不同组大鼠比目鱼肌筋膜下的线粒体数目。使用透射电镜特殊成像系统(美国)进行拍摄。每只大鼠所取样本制作5张电镜切片,每张切片随机拍摄6张图片。计数时只统计视野范围内可见的完整线粒体与自噬体,若出现线粒体或自噬体位于图像边缘,未整体进入图片内则不予计入,图片内未见自噬体则记为0个。

1.4.2 线粒体提取方法

取质量约为50~100 mg的新鲜比目鱼肌。在1.5 mL离心管内对剪取的组织进行称重。用PBS洗涤1次。把组织放在一个置于冰上的培养皿中,用剪刀把组织剪切成非常细小的碎片后,加入10倍体积预冷的PBS,冰浴3 min后置于600 rpm转速离心10~20 s,沉淀样品,弃上清。再加入8倍体积预冷的胰酶消化液,冰浴20 min后置于600 rpm转速离心10~20 s,沉淀样品,弃上清。随后加入2倍体积相应线粒体分离试剂,重悬组织,用于洗去残余的胰酶。置于600 rpm转速离心10~20 s,沉淀样品,弃上清。加入8倍体积预冷的相应线粒体分离试剂或临用前添加了PMSF的线粒体分离试剂,冰浴环境匀浆20~30次,完成后置于600 rpm转速,4℃离心5 min。将上清液转移到另一离心管中,11 000 rpm转速,4℃离心10 min。去除上清,沉淀即为分离得到的线粒体。

1.4.3 线粒体ATP浓度测试

使用ATP Assay Kit通过比色法进行比目鱼肌线粒体ATP浓度测试(Ab-83355):采用试剂盒所提供标准液制备工作标准液。用100 μL ATP Assay Buffer使样本悬浮混匀。在4℃低温离心机中使用最高转速离心2 min以除去所用不溶性物质。取上清液,在每个标准和样本孔中都加入50 μL Reaction Mix。在每个样本背景控制孔中加入50 μL背景反应混合溶液。在室温下避光混合和孵化30 min后用酶标仪在OD 570 nm下进行测量。

1.4.4 丙酮酸脱氢酶活性测试

使用丙酮酸脱氢酶活性测试试剂盒(Ab-109902)进行比目鱼肌线粒体丙酮酸脱氢酶浓度测试:在样品溶解前测量样品的蛋白含量,制备相应浓度的PDH。冰上孵育10 min后置于5 000 rpm转速4℃离心10 min,提取上清液,用孵育液将所有样本稀释后向每个孔中加入样本200 μL,室温孵育3 h后将测试孔中内容物甩出,迅速加入300 μL稳定液和200 μL 1X Detector Antibody。室温孵育1 h后,将测试孔中内容物甩出,迅速加入300 μL稳定液和200 μL 1X HRP La‐bel,室温孵育1 h后再向每孔迅速加入200 μL HRP Develop‐ment solution后置于酶标仪中进行测试。以100 mg/min蛋白变化0.01 OD为1个酶活力单位/(a.u.)。

1.4.5 骨骼肌WB测试方法

WB测试所用一抗为:Anti-PI3-k,Ab40776;Anti-BNIP-3 Ab109362。WB测试方法与前期研究一致(蒋中业等,2019)。大鼠O2max和力竭时长在每2周1次的O2max测试中获得。

1.5 数据分析方法

采用Image Lab 5.2对WB测试所得蛋白相对含量数据进行采集;条带分析中,以基线值作为参考对照,运用Image Lab 5.2对条带进行灰度分析,得到各样本蛋白含量的相对值;所有结果均表示为平均值±标准差的形式。

由于每组大鼠来源于同一总体,基因条件以及生活环境一致,因此每组大鼠的随机抽样取材均可作为对该组的重复测量,所得各组大鼠的O2max、力竭时间、BNIP3和PI3-k相对表达量及线粒体丙酮酸脱氢酶活性及ATP浓度数据采用SPSS 19.0进行统计分析,组内两两对比采用单因素方差分析进行处理,组间比较采用配对样本t检验,P<0.05为有显著性差异,P<0.01为有极显著性差异。

2 研究结果

2.1 HIIT对大鼠递增负荷运动至力竭时长的影响

16周的增龄过程中,C组大鼠递增负荷运动至力竭的时长在第8周和16周时显著低于基线值(P<0.05,P<0.05);H组在第8周和16周时大鼠递增负荷运动至力竭的时长显著高于基线值(P<0.01,P<0.05;表2)。

表2 大鼠力竭时间结果Table 2 Results of Exhaustion Time of Rats s

2.2 HIIT对大鼠O2max的影响

16周自然增龄使大鼠的V̇O2max显著降低(P<0.05)。持续8周和16周的HIIT干预可以使增龄大鼠的O2max相比于基线值显著提高(P<0.01,P<0.01),且16周时相比于第8周显著升高(P<0.05)。H组在8周和16周时均显著高于C组(P<0.01,P<0.01;表3)。

表3 大鼠O2max结果Table 3 Results of O2maxof Rats ml·kg-1·h-1

表3 大鼠O2max结果Table 3 Results of O2maxof Rats ml·kg-1·h-1

注:**表示与C组相比有极显著性差异(P<0.01);&表示与第8周时相比有显著性差异(P<0.05);下同。

H组2 768.67±628.74 2 705.44±477.36 2 784.67±519.18 3 250.63±489.58 3 469.11±386.43**##3 508.22±279.82 3 460.94±418.68 3 716.61±717.14 3 907.22±575.58**##&时间基线值第2周第4周第6周第8周第10周第12周第14周第16周C组2 751.74±572.99 2 607.89±522.18 2 410.89±315.88 2 236.06±375.61 1 988.95±521.57 1 905.98±311.12 1 772.06±422.68 1 684.56±478.61 1 446.52±319.15#

2.3 HIIT对大鼠比目鱼肌线粒体丙酮酸脱氢酶活性与ATP浓度的影响

16周增龄过程中各组大鼠丙酮酸脱氢酶活性无明显变化,且8周和16周时的组间对比中无显著差异(表4)。

表4 丙酮酸脱氢酶活性比较Table 4 Results of Pyruvate Dehydrogenase Activity a.u.

16周增龄过程中,C组比目鱼肌线粒体ATP浓度呈先升后降的趋势,H组呈上升趋势(表5)。16周时,H组大鼠比目鱼肌线粒体ATP浓度显著高于C组和基线值(P<0.05,P<0.05)。

表5 线粒体内ATP浓度结果Table 5 Results of ATP Concentration in Mitochondria nmol·ul-1

2.4 HIIT对大鼠骨骼肌线粒体自噬体数目的影响

16周过程中各组比目鱼肌自噬体数目呈现上升趋势(图1,表6)。16周过程中C组线粒体数目呈下降趋势,H组呈上升趋势(表7)。干预至第8周时,H组线粒体数目显著高于C组(P<0.05)和基线值(P<0.05)。干预至第16周时,H组线粒体数目显著高于C组(P<0.05)和基线值(P<0.05)。在第8周和第16周时,虽然C组自噬体数目均多于H组,但各组大鼠在组间和组内对比中均未见显著性差异。

图1 透射电镜下比目鱼肌自噬体Figure 1.Autophagosome of Soleus Muscle under Transmission Electron Microscope

表6 线粒体自噬体数目Table 6 Number of Mitochondrial Autophagosomes 个

表7 线粒体数目Table 7 Numbers of Mitochondrial 个

2.5 HIIT对大鼠骨骼肌BNIP3和PI3-k表达量的影响

16周过程中C组BNIP3表达量呈现上升趋势,H组呈现先升后降的趋势(图2,表8)。干预至第8周时,C组BNIP3表达量显著高于基线值(P<0.05);H组BNIP3表达量显著高于基线值(P<0.01)。干预至第16周时,C组BNIP3表达量显著高于基线值(P<0.01);H组BNIP3表达量显著高于基线值(P<0.01)。

图2 大鼠比目鱼肌BNIP3和PI3-k蛋白WB结果Figure 2.BNIP3 and PI3-k Protein in Soleus Muscle of Rats

表8 BNIP3蛋白表达量变化Table 8 Changes of BNIP3 Protein Expression

16周增龄过程中,C组大鼠比目鱼肌PI3-k蛋白表达量呈现持续上升趋势,H组呈现先升后降的趋势(图2,表9)。第16周时,C组大鼠比目鱼肌内PI3-k蛋白含量显著高于基线值(P<0.05),H组与基线值未见显著性差异。

表9 PI3-k蛋白表达量变化Table 9 Changes of PI3-k Protein Expression

3 分析讨论

3.1 HIIT对大鼠运动能力和O2max的影响

有研究表明,运动训练可以有效提高骨骼肌线粒体内氧化酶活性和ATP合成能力(Short et al.,2003),ATP合成能力的变化对大鼠O2max有一定影响(蒋中业等,2019)。HIIT延缓大鼠增龄过程中的O2max下降可能是通过影响骨骼肌线粒体来实现的。

3.2 HIIT对大鼠比目鱼肌线粒体中丙酮酸脱氢酶活性与ATP浓度的影响

本研究表明,16周增龄过程中,无论是否进行HIIT干预大鼠比目鱼肌线粒体内丙酮酸脱氢酶浓度均未见明显变化,说明增龄和HIIT均无法对大鼠比目鱼肌线粒体供能能力产生影响。16周增龄过程中大鼠比目鱼肌线粒体ATP浓度呈现先升高后下降的趋势,与Short等(2005)的研究结果一致,且Hepple(2014)研究表明这一现象的发生早于骨骼肌质量的下降。这说明增龄导致大鼠比目鱼肌线粒体ATP浓度降低。16周HIIT干预使大鼠比目鱼肌线粒体中的ATP浓度升高,并且在16周时显著高于自然增龄大鼠。这说明16周的HIIT运动对大鼠增龄过程中比目鱼肌ATP浓度具有显著的促进作用,结合大鼠线粒体数目的变化,本研究认为,大鼠比目鱼肌ATP浓度变化可能与线粒体数目变化有关。第8周时两组大鼠线粒体ATP浓度未见显著性差异,可能是由于骨骼肌线粒体中ATP浓度与线粒体氧化酶活性(陈雅维,2020;Safdar et al.,2010;Short et al.,2003)有关,线粒体氧化酶活性变化与线粒体数目变化在16周增龄及HIIT干预过程中不同步所致,也可能是因为随着大鼠年龄的增长,短期的运动锻炼难以使其线粒体功能得到有效改善,此现象出现的原因仍需进一步探索。

在16周增龄过程中,大鼠ATP浓度和线粒体数目出现显著性差异,而线粒体ATP合成能力无明显变化。因此,推测比目鱼肌线粒体ATP浓度的变化与线粒体自噬以及线粒体数目变化密切相关(Chiao et al.,2016)。

3.3 HIIT对大鼠比目鱼肌线粒体BNIP3和PI3-k的影响

BNIP3是存在于哺乳动物细胞内的一些线粒体标记蛋白,可通过直接与LC3结合(Ney,2015),竞争Beclin-1与Bcl-2/Bcl-xl的结合(Maiuri et al.,2009;Zeng et al.,2013),减少线粒体磷酸化和ATP含量(徐冉等,2013)等途径引起线粒体自噬。BNIP3的表达与自噬的激活呈正相关关系。崔迪(2013)研究表明,6周跑台运动使小鼠腓肠肌BNIP3表达量出现上升趋势。4周中等强度运动可以使大鼠骨骼肌BNIP3表达量升高同时诱导线粒体自噬增强(于亮等,2020)。杜涛等(2014)在脂多糖调控巨噬细胞自噬的研究中分别阻断PI3-k和mTOR,发现BNIP3表达量的升高均伴随着自噬增强。本研究证实,16周的自然增龄和HIIT干预均会使大鼠比目鱼肌BNIP3表达量升高,且相较于自然增龄,HIIT干预使得大鼠增龄过程中比目鱼肌BNIP3表达量升高出现得更早、更明显。这说明在16周增龄过程中,HIIT运动可能通过调控BNIP3的表达促进了大鼠增龄过程中线粒体自噬的发生。

PI3-k作为反映线粒体自噬和凋亡的重要下游指标,其经过PI3-k/AKT/mTOR途径激活AKT和mTOR(舒婷等,2016;Rodon et al.,2013;Zhang et al.,2016;Zhao et al.,2015),抑制自噬。有研究表明,抗阻和有氧等多种运动形式均可通过调控PI3-k途径有效影响机体自噬的发生:抗阻运动(房国梁等,2016)和耐力运动(李锋等,2018)可以上调脑组织中PI3-k的表达,有效提升老年大鼠心肌PI3-k的表达(谢金凤,2020),并对下游底物产生积极影响进而调控自噬的激活;有氧运动可以上调大鼠和小鼠骨骼肌中PI3-k的表达(刘霞等,2012),使骨骼肌自噬减弱(樊申元等,2016);间歇运动可以通过上调心肌PI3-k/Akt途径抑制心肌细胞自噬与凋亡(谭支内等,2016)。然而本研究显示,16周的自然增龄和HIIT干预中PI3-k的升高趋势虽然与上述研究结果相同,但是各组之间并未出现与其一致的显著性差异。推测出现这种现象的原因是上述研究中大部分使用的研究对象为6~8周龄的青年大鼠或21月龄的衰老大鼠模型,且均使用某一固定方案进行运动干预,而本研究中大鼠HIIT干预的运动强度根据每2周1次的O2max测试结果进行调整,随着大鼠年龄增长,HIIT干预中的高强度阶段较大强度的运动刺激了线粒体自噬的发生(马晓雯等,2016),此现象出现的原因仍需进一步研究探索。

虽然本研究中各组大鼠的BNIP3和PI3-k变化结果均表明大鼠比目鱼肌线粒体自噬产生了变化,电镜下观察的自噬体数目也出现了增多的趋势,但各组大鼠比目鱼肌自噬体数目未出现显著性差异,推测可能是由于取材前的O2max测试强度较大,引起各组大鼠骨骼肌线粒体发生一过性自噬增强所致(高扬等,2020)。因此,在未来的研究中应避免大鼠在取材前72 h内进行剧烈运动。

综上所述,16周HIIT干预使大鼠比目鱼肌线粒体数目增多,ATP浓度升高,机体有氧运动能力增强。同时,相比自然增龄大鼠,16周HIIT干预对大鼠比目鱼肌线粒体自噬激活程度影响更大。线粒体丙酮酸脱氢酶活性无明显变化,可以一定程度上说明线粒体ATP浓度的增加与线粒体数目变化有关。因此,本研究结合李渊芳等(2019)提出的自噬是调控线粒体数目的重要方式的观点,推测HIIT干预使大鼠健康线粒体数目增多以及ATP合成能力增强是通过调控大鼠增龄过程中的自噬以及线粒体合成实现的。

4 结论

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