预防用mRNA疫苗非临床安全性研究一般原则及关注点

陈 波，关亚娜，郭 伟，顾 辉，朱睿明，吕 琳，扈正桃，岑小波，2

（1.成都华西海圻医药科技有限公司，四川 成都 610041；2.四川大学华西医院国家成都新药安全性评价中心，四川 成都 610041）

信使 RNA（messenger RNA，mRNA）疫苗是将mRNA在体外进行相关修饰后传递至机体细胞内表达并产生蛋白抗原，刺激机体产生特异性免疫反应的一类新型核酸疫苗。mRNA疫苗的研发可追溯至1990年，Wolff等［1］将体外转录的 β-半乳糖苷酶mRNA注射到小鼠骨骼肌，成功检测到其表达的β-半乳糖苷酶蛋白。此后研究表明，体外转录的mRNA可在体内编码相应蛋白并产生细胞免疫和体液免疫反应［2-4］，提示mRNA具有潜在的治疗和（或）预防疾病的效应。但由于mRNA自身序列结构的稳定性差，免疫应答及自发跨膜效率低，限制了mRNA疫苗的研发。近20年，随着核酸修饰及递送载体技术的快速发展，mRNA疫苗的临床转化及应用发展迅速。2021年2月《麻省理工科技评论》发布的2021年“十大突破性技术”中，mRNA疫苗位居榜首。迄今，全球有2款mRNA疫苗获美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）和欧洲药品管理局（European Medicines Agency，EMA）批准，分别为德国生物新技术公司（BioNTech）与美国辉瑞公司合作研发的BNT162b2和美国莫德纳（Moderna）公司研发的mRNA-1273，两者在全球新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）疫情中表现出从研发到临床应用的快速转化能力、良好的人群保护力和安全性。本文从mRNA疫苗基本生物学特征出发，结合全球现有的相关指导原则、非临床及临床研究、相关研究评价资料，重点讨论预防用mRNA疫苗在非临床安全性研究中的一般原则和关注点，为预防用mRNA疫苗研发和临床不良反应监测预警提供参考。

1 mRNA疫苗基本生物学特征

1.1 基本生物学信息

mRNA是一类携带编码蛋白质合成信息的单链核糖核酸。一个经典的mRNA应包括5个必要区域：从5′端至3′端依次是5′端帽（5′Cap）结构、5′非编码区（untranslated region，UTR）、开放阅读框（open reading frame，ORF）、3′UTR和多聚腺嘌呤核糖核苷酸〔Poly（A）〕序列。5′Cap保证mRNA以正确的方向指导蛋白质翻译，Poly（A）主要增加mRNA的稳定性，5′UTR和3′UTR增强mRNA的翻译效率，ORF是编码蛋白质的密码子。mRNA疫苗则是基于mRNA编码蛋白合成的特性，据特定蛋白抗原的密码子序列设计ORF，在体外合成mRNA后通过适当修饰和加工，递送入机体细胞并表达相应蛋白抗原，经抗原呈递细胞呈递后引发机体免疫反应［5］。在此过程中，mRNA及其载体可引发细胞免疫反应，mRNA翻译后生成的蛋白抗原可引发体液和细胞免疫反应，体液免疫反应可生成针对病原体的中和抗体。mRNA疫苗在体内免疫过程见图1［6］。mRNA疫苗注射后，注射部位的免疫反应导致大量免疫细胞招募，包括白细胞、髓样树突细胞、浆样树突细胞和单核细胞等。大多数类型的免疫细胞均可摄取mRNA疫苗并表达抗原，同时分泌白细胞介素1（interleukin-1，IL-1）。免疫细胞迁移至引流淋巴结并呈递抗原后，抗原与B细胞的相互作用导致生发中心形成，产生浆细胞和记忆型细胞随淋巴系统迁移并驻留于骨髓中。

mRNA疫苗主要由编码抗原的mRNA序列和递送载体构成。根据mRNA进入体内后能否进行自我复制，将mRNA疫苗分为非复制型mRNA疫苗和自我扩增型mRNA（self-amplifying mRNA，SAM）疫苗。前者mRNA的构成与传统mRNA类似，其ORF仅包括编码抗原的基因；后者mRNA的ORF除包含编码抗原的核苷酸序列外，还包括来源于病毒的复制元件，翻译后使mRNA进行扩增，从而持续表达抗原（≥2个月）［7］。

mRNA递送载体对于mRNA疫苗的稳定性和免疫应答至关重要。目前常用于mRNA疫苗的递送载体包括鱼精蛋白、脂质体及聚合物等。EMA和美国FDA批准上市的疫苗BNT162b2和mRNA-1273均采用脂质纳米粒（lipid nanoparticles，LNP）作为mRNA疫苗递送载体。LNP通常由可电离脂类、天然磷脂、胆固醇和聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）构成［8］。

1.2 特点

与灭活疫苗和减毒活疫苗等传统类型疫苗相比，mRNA疫苗具有一些特殊的优势：①mRNA疫苗包括mRNA和递送载体两部分，其中递送载体通用性较强；mRNA的免疫学效应依赖于病原体蛋白和核苷酸序列，可通过核酸修饰提高病原体蛋白的翻译效率，从而增强疫苗活性。理论上，经过适当修饰或改造的mRNA可编码任何一种蛋白。②不同类型mRNA疫苗的生产及纯化工艺相似，无需类似于传统生物类产品较长的生产或发酵周期，生产过程简单高效，可快速应对全球爆发的传染性疾病。③与DNA疫苗相比，mRNA疫苗在胞质中即可翻译抗原，因此基因整合风险很低。④外源性mRNA本身具有免疫原性，通过激活模式识别受体引发固有免疫反应，表现出“自我佐剂（self-adjuvant）”的特点。⑤ 递送载体LNP除稳定和保护mRNA外，也具有一定的免疫原性，可增强疫苗的免疫反应。⑥在近年COVID-19疫情中，随着新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）变异株德尔塔（Delta）和奥密克戎（Omicron）的出现，与其他类型疫苗相比，mRNA疫苗仍表现出有效性和安全性［9-10］。

但目前mRNA疫苗的储运条件较为苛刻，稳定性较差。如已上市的2个mRNA疫苗的储运条件分别为-70℃（BNT162b2）和 -20℃（mRNA-1273），且因mRNA稳定性较差，易被核酸酶降解，对接种环境的要求亦相对较高。此外，目前的临床数据显示，接种mRNA疫苗后仍存在一定的不良反应［11］。上述因素使mRNA疫苗的应用面临较多的挑战。

2 mRNA疫苗非临床安全评价相关指南

mRNA疫苗作为疫苗的一种，应遵循包括但不限于世界卫生组织（World Health Organization，WHO）针对疫苗及其佐剂的指导原则［12-13］和ICH S5（R3）中涉及疫苗的生殖毒性试验的指导原则［14］。mRNA作为基因治疗的手段之一，还需参考基因和细胞治疗相关的指导原则［15］。另外，由于mRNA疫苗具有特殊性，WHO于2021年颁布了专门针对mRNA疫苗研发的指南Evaluation of the Quality，Safety and Efficacy of Messenger RNA Vaccines for the Prevention of Infectious Diseases：Regulatory Considerations［16］。该指南着重对mRNA疫苗在生产、非临床和临床评价过程中的关键点提供指导。值得注意的是，该指导原则虽在COVID-19疫情的大背景下出台，但并非仅适用于SARS-CoV-2疫苗，也并非适用于所有mRNA疫苗。鉴于LNP为目前最主要的mRNA递送载体，该指导原则适用于由LNP递送的mRNA或SAM预防用mRNA疫苗，其他类型递送载体的mRNA或SAM预防用mRNA疫苗则根据产品的实际情况灵活应用。该指导原则不适用于由病毒蛋白包装或质粒DNA编码的疫苗以及治疗用mRNA疫苗。

我国药品监督管理局药品审评中心（Center for Drug Evaluation，CDE）于2005年制定了《预防用生物制品临床前安全性评价技术审评一般原则》，主要适用于传统疫苗如灭活疫苗、减毒活疫苗、纯化疫苗、重组DNA技术制备的抗原疫苗、结合疫苗、合成肽疫苗以及使用新佐剂疫苗的非临床安全性评价研究。为应对COVID-19疫情，我国CDE于2020年制定了一系列指导原则，如《新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则（试行）》《新型冠状病毒预防用疫苗研发技术指导原则（试行）》《新型冠状病毒预防用疫苗非临床有效性研究与评价技术要点》等，但目前尚无针对mRNA疫苗的非临床安全性研究指导性文件。

3 预防用mRNA疫苗非临床研究

mRNA疫苗的非临床研究评价既要符合传统疫苗研究的一般原则，也因其结构及作用机制的特点、按照“具体问题具体分析”的原则进行科学设计。参考WHO发布的相关研究指南［16］，本文就预防用mRNA疫苗的非临床安全性研究的一般原则及关注点进行讨论。

3.1 一般原则

3.1.1 试验类型

预防用mRNA疫苗非临床安全性评价一般应至少进行重复给药毒性、免疫毒性、局部耐受、安全药理和生殖毒性试验等［17-18］，其中免疫毒性、局部耐受和安全药理试验可伴随于重复给药毒性试验中开展。考虑到mRNA疫苗缺少基因整合性，通常无需进行遗传毒性和致癌性试验。若疫苗组分中包含有新型的递送载体、佐剂和（或）赋型剂时，应考虑对新的组分单独进行全面的非临床安全性评价，否则应提供充分的理由。

在重复给药毒性试验中，常规检测指标通常包括动物体重、摄食量、注射部位刺激性反应、临床病理学指标（血液学、血生化、血凝和尿常规等）、安全药理学指标（体温、心电图、呼吸频率和神经行为）、脏器重量及组织病理学检查等指标。此外，还需特别关注免疫原性及免疫毒性指标，检测内容一般包括与体液免疫（抗病原蛋白抗体及中和抗体）和细胞免疫反应等相关的免疫细胞（如Th1，Th2，CD4+T和CD8+T细胞等）数量或比例的改变、细胞因子（白细胞介素、干扰素和集落刺激因子等）水平、急性期蛋白（C-反应蛋白和血清淀粉样蛋白等）和淋巴免疫组织（给药部位淋巴结和脾）病理学检查等指标。若疫苗组分中有通过直接作用于免疫系统而发挥作用的成分，或者靶抗原与内源性分子存在相似性，尚需关注由于免疫刺激过强导致超敏反应或自身免疫反应的可能性。此外，由于发热是临床上疫苗接种后常见的反应之一，考虑到非临床研究中试验操作的可实施性，可在大动物（如猴和犬等）重复给药中增加温度监测。

对于脂质递送系统的安全性研究包括组织分布和一般毒性研究。由于单一脂质成分的生物分布与递送系统中脂质成分在体内可能存在组织分布的差异，可在单次及重复给药毒性试验中设置不含mRNA的脂质递送系统对照组，以检测脂质递送系统的毒性反应［18］。

为预测mRNA疫苗潜在的临床风险，非临床研究的试验样品需使用能够代表临床拟用的疫苗制剂。如非临床研究使用的样品与临床试验用样品存在差异，需进行相关桥接试验以评估这种差异对疫苗安全性和有效性带来的潜在影响。

3.1.2 动物种属选择

mRNA疫苗的重复给药毒性试验一般需在2个相关动物种属（啮齿类和非啮齿类）中进行，生殖毒性试验可仅在1个相关动物种属中进行。在进行动物种属选择时，应考虑实验动物免疫系统或免疫应答与人体的相似性及所引起免疫反应的强弱等。免疫系统或免疫应答与人越相近或免疫反应越强，则试验结果所获得的毒性信息的评估权重越高。若非人灵长类是唯一可产生免疫反应的动物种属，且无适宜的替代分子或人源化的转基因动物时，则mRNA疫苗非临床安全性评价应考虑采用非人灵长类动物。

3.1.3 剂量设计

mRNA疫苗毒性试验的剂量设计通常选择临床试验拟用的最高剂量（按人份计），建议增设动物免疫原性和（或）保护力试验中的最佳剂量，以考察治疗剂量下疫苗的毒性风险。此外，高于临床拟用剂量的设计可支持临床研究中可能增加的剂量。若受实验动物给药体积的限制，试验剂量难以达到临床拟用剂量时，可采取相同途径多点注射的方式；若仍不能达到临床拟用剂量，至少采用临床折算剂量（基于公斤体重）进行试验。免疫次数和频率可依据免疫原性试验结果进行设计，通常情况下免疫次数需比临床拟定次数至少多1次。然而，为增强保护力或应对病毒突变，在临床试验或应用中不排除使用比初期临床试验中更多的免疫次数。因此，非临床研究应充分考虑临床应用中的可能性［19］。

除常规的剂量设计外，中和抗体滴度也可作为不同种属动物和临床人体的“毒代暴露量”。为充分暴露疫苗的潜在风险，安全性试验中动物产生抗体的滴度应至少涵盖临床免疫的有效抗体滴度。

3.1.4 免疫应答

mRNA疫苗注射进入机体后，递送载体、单链mRNA、mRNA自发形成的二级结构、体外转录mRNA过程中形成的双链mRNA和mRNA翻译后形成的抗原均可能激发机体的固有免疫，而固有免疫对由靶抗原呈递引起的适应性免疫起着关键作用。固有免疫反应过强，一方面会降低靶抗原的翻译效率，起不到疫苗的预防作用；另一方面，可能会刺激机体产生较高水平的细胞因子，甚至导致“细胞因子风暴”。固有免疫过弱，则无法诱发机体产生适应性免疫。因此，平衡固有免疫反应对mRNA疫苗的安全性与临床应用至关重要。

在非临床安全性研究中，可从以下方面考察mRNA疫苗的免疫反应：①T细胞依赖性抗体反应（T cell dependent antibody response，TDAR）是B细胞针对T细胞依赖性抗原产生的抗体应答，需要Th2细胞的辅助方可产生特异性抗体。TDAR试验可通过引入外来抗原检测机体产生的IgM和IgG水平，从而反映受试疫苗潜在的免疫毒性。②外周血单个核细胞及全血细胞体外细胞因子检测可用于筛选有潜在药理或毒理作用的细胞因子，有助于明确候选疫苗的临床非预期效应，一般在研发早期进行。③关注补体的检测。寡核苷酸链中带电荷的骨架可能会激活非人灵长类的补体旁路途径［20-22］，因此在猴重复给药毒性试验中需关注补体的检测。

此外，若mRNA所编码的抗原在抗原呈递细胞中未表达，而在其他细胞中表达时，则可能发生免疫无能（immune anergy），进而导致免疫耐受。但目前尚无较好的针对免疫耐受评价的试验方法，组织分布试验可能有助于判定靶抗原在呈递细胞中的表达谱，对是否产生免疫耐受有提示作用。

3.1.5 组织分布

研究表明，人体所有细胞均表达低密度脂蛋白受体［23-24］，这些受体可介导LNP包裹的mRNA疫苗的内吞作用，因此大多数细胞均可能是mRNA疫苗的受体细胞。编码抗原的mRNA在受体细胞中表达及mRNA疫苗自身在相应的组织或器官中的异常聚集和代谢，可能会引发机体潜在的安全性风险。mRNA纳米粒递送载体材料的组成、表面电荷、粒径的大小以及疫苗注射方式等均可能影响mRNA疫苗的生物分布。例如，脂质体中的PEG可延长体内递送载体的半衰期，减少载体和血浆蛋白的非特异性作用并提供空间位阻增强载体的稳定性，但高浓度PEG也可能会抑制LNP与质膜的相互作用，从而阻碍细胞对LNP的吸收［25］。带正电荷的LNP优先靶向小鼠肺，带负电荷的LNP主要靶向脾，不带电荷的LNP优先靶向肝［26-27］。注射到机体组织中粒径＜200 nm的mRNA疫苗颗粒更易被输运到淋巴系统，而更大的颗粒则保留在注射部位［28］。因此，mRNA疫苗的组织分布评价，对潜在靶器官及毒性作用的发现具有重要意义。

目前常用于mRNA疫苗组织分布研究的方法包括免疫荧光法、放射性同位素标记法、近红外成像技术和实时荧光定量聚合酶链反应（real time-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）。免疫荧光法通常是将LNP作为递送系统包裹萤火虫荧光素酶mRNA的疫苗注射至动物体内，然后通过活体成像观察荧光素酶的分布而判断mRNA疫苗的组织分布。由于荧光素酶的表达无法完全模拟编码抗原mRNA的表达谱，因此免疫荧光法主要评价递送载体对mRNA疫苗组织分布的影响，具有一定的局限性。放射性同位素标记法和近红外成像技术分别是用放射性同位素和近红外探针标记编码抗原的mRNA，将mRNA疫苗注射至体内后，利用正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（PET/CT）和近红外成像技术追踪其组织分布情况，两者可避免免疫荧光法的缺陷，同时评价递送载体和抗原mRNA的组织分布，可较全面地检测mRNA疫苗的分布器官或组织。RT-qPCR是在拟定时间点解剖动物后检测组织脏器中靶抗原mRNA的水平。RT-qPCR定量准确，操作简单，是开展组织分布研究常用的方法之一。但该方法以解剖为终点，难以在同一只动物中对疫苗分布情况进行实时动态监测。

3.1.6 生殖毒性

疫苗对机体生殖发育的不良反应主要是由疫苗与母体免疫系统的直接作用或继发作用造成的，如增强的Th1型免疫反应可导致妊娠失败或流产［29］。此外，如果母体产生的抗体与胚胎或胎仔组织脏器产生交叉反应，特别是抗原分子对处于发育关键期的器官产生较大影响时，可能使胎仔发育的器官产生畸形。随着疫苗应用范围及人群的扩大，有些疫苗可应用于孕妇，因此开展疫苗生殖与发育毒性评价非常必要。但由于疫苗给药剂量较小，尤其是mRNA疫苗在理论上不会进入细胞核，其生殖毒性的风险相对传统疫苗较低。

单一周期的疫苗注射周期多在妊娠后10～14 d，如传统的啮齿类及兔胚胎-胎仔发育毒性试验。但需注意的是，在该周期内疫苗一般尚不能充分诱导机体产生充分的疫苗抗体暴露，而且在特定的胚胎发育周期内，不同种属动物的胎盘转运机制不同，会导致疫苗中和抗体转运效率不同［30］。因此，mRNA疫苗生殖和发育毒性研究采用全周期的设计方式可能是较好的选择。

全周期的生殖毒性试验设计通常需要雌、雄鼠从交配前开始给药，雌鼠需持续给药至妊娠及哺乳结束，检测指标至少包括亲代雌、雄鼠母体毒性指标（体重和摄食量）、生殖毒性指标（生殖系统重量及组织学检查、精子活力及形态学检查）、胚胎-胎仔发育毒性（活胎、吸收胎和死胎计数，胎仔外观，骨骼和内脏检查）及F1代大鼠生长发育指标（存活率、体重、生理发育指标、条件反射指标和学习记忆行为等）。

3.2 其他考虑因素

3.2.1 递送载体

目前mRNA疫苗最常用的递送载体为基于平台技术的LNP，其组成较为复杂［21］。如前所述，LNP可影响mRNA疫苗的吸收、分布、代谢和排泄过程，进而影响其药理和毒理效应。此外，LNP本身也具有一定的免疫调节作用。因此，当LNP的脂质成分、构成比例发生改变或存在新的结构修饰时，需考虑对载体进行安全性评价，通常包括一般毒性和遗传毒性研究。

3.2.2 多联多价疫苗

mRNA疫苗作为一种新型疫苗，随着病毒抗原的变异，疫苗的临床应用方案可能处于不断完善和调整中，在实际临床应用中也可能遇到各种疑问或挑战，而这些疑问难以在早期的非临床研究中得到考察或解释。例如，①对于多次接种的疫苗，不同技术路线的疫苗或不同平台相同靶抗原的mRNA疫苗是否可混合使用？②针对不同靶抗原的mRNA疫苗是否可同时接种？③针对同一病原体的不同亚型的mRNA疫苗是否可同时接种？④同一递送载体是否可包裹不同靶抗原mRNA？就以上问题，目前国际上尚无明确的指导原则或法规建议。因此，进行全面的非临床研究时，除参考我国《联合疫苗临床前和临床研究技术指导原则》外，应结合疫苗作用机制、疫苗非临床或（和）临床数据，综合评估多联多价疫苗应用时的潜在风险。

4 预防用mRNA疫苗非临床安全性风险评估

4.1 基于非临床试验结果的综合评估

mRNA疫苗诱导的免疫功能异常或免疫毒性需要重点关注。不同种属动物及人体的免疫功能存在一定差异，故疫苗产生的免疫反应也可能不同。同一疫苗在相同剂量条件下，不同种属动物产生的中和抗体滴度可能存在较大差异，甚至在某一动物种属可能不会产生特异性中和抗体。因此，非临床试验中需选择疫苗敏感的动物种属且中和抗体滴度超过临床研究的有效抗体滴度，一般才能为安全性评价提供更充分的风险评估。同时，不同种属间免疫毒性研究结果的差异也需进行综合评估。

除体液免疫反应外，mRNA疫苗还可调节部分T细胞的免疫功能。mRNA疫苗在一定程度上模拟病毒感染，因而可促进CD8+T细胞反应；CD4+T细胞也可参与B细胞分化从而建立疫苗的免疫记忆反应。例如，某编码RABVG基因的mRNA疫苗在体外系统、小鼠及小型猪中可诱导RABVG特异性的CD4+和CD8+T细胞反应，干扰素γ、肿瘤坏死因子、IL-2和CD107a表达明显升高［31］。而该疫苗在Ⅰ期临床试验中仅在第3次接种后可见一过性的RABVG特异性的CD4+T细胞反应［32］。Moderna公司的预防SARS-CoV-2感染的mRNA疫苗在小鼠体内可诱导明显的CD4+和CD8+T细胞反应，包括刺突糖蛋白（spike glycoprotein，S蛋白）或受体结合区域特异性干扰素γ分泌增加［33-35］，而在猴和人体内仅可见特异性CD4+T细胞反应［36-37］。

除免疫毒性外，也应关注疫苗的一般毒性，尤其是新型递送系统带来的潜在毒性。例如，在毒性试验中，mRNA疫苗给药动物肝组织出现与LNP递送载体相关的空泡性改变［38-40］，这可能与LNP递送载体在肝分布浓度较高或留存时间较长相关，提示应关注并评估mRNA疫苗临床接种后的风险。

4.2 基于临床-非临床的综合评估

mRNA疫苗的临床转化应基于对已有临床数据的分析，尤其是临床使用中出现的不良反应及其机制对指导mRNA疫苗非临床研究具有重要的指导意义。临床试验及应用中发现，mRNA疫苗接种者常见的疫苗不良反应包括疲劳、发冷、头痛、肌痛、关节痛、发热和头晕等。有研究认为，LNP组分如PEG和电离脂质体等可激活不同的炎症途径，导致炎症细胞因子如IL-1和IL-6的产生，且LNP可扩散至全身各处，进而导致局部或全身炎症，可能是造成mRNA疫苗不良反应的主要因素之一［41］。此外，近期的一些研究发现，与对照组人群相比，mRNA疫苗接种人群脑血管疾病、栓塞性卒中、短暂脑缺血、深静脉血栓、心肌炎（心包炎）和过敏反应的发生率略微升高［12，42-45］。脑血管疾病、栓塞性卒中、短暂脑缺血和脑静脉血栓可能是由免疫性血栓性血小板减少症（vaccine-induced immune thrombotic thrombocytopenia，VITT）导致［46］。VITT在疫苗接种人群的发生率并不高，然而由于其导致的后果较为严重，需密切关注。VITT致病机制并不明确，可能的原因包括由血小板因子4（platelet factor 4，PF4）抗体和S蛋白作用导致，其中PF4为荷正电的血小板蛋白，与荷负电的分子如mRNA疫苗的组分结合后，形成具有免疫原性的复合物，可诱发机体产生PF4-聚阴离子抗体，进一步激活下游通路导致血小板减少和（或）血栓形成［43，47］。对于S蛋白导致VITT的作用机制，可能是SARS-CoV-2疫苗特异性作用导致。研究表明，SARS-CoV-2游离的S蛋白可直接活化血小板，导致凝血因子释放，最终导致血栓和（或）血小板减少［47-48］。关于VITT的致病机制还需进一步研究，如在mRNA疫苗非临床研究中，可通过检测PF4-聚阴离子抗体及游离S蛋白的含量评估疫苗的潜在毒性。基于VITT发病率较低，在非临床研究中少数个体动物PF4-聚阴离子抗体及游离S蛋白含量的升高，可能具有相关潜在毒性的提示性。

心肌炎（心包炎）和过敏反应是目前报道较多的mRNA疫苗相关的另外2类不良反应［12，42］。有研究表明，心肌炎（心包炎）发生人群多为青少年群体，且mRNA-1273（美国Moderna）所致心肌炎（心包炎）发生率高于BNT162b2（德国BioNTech/美国辉瑞）［48］。临床试验结果显示，BNT162b2在5～11岁儿童中具有良好的安全性，未发现心肌炎（心包炎）等与疫苗相关的严重不良事件［49］。因此，德国卫生部门建议≤30岁人群接种BNT162b2，而非mRNA-1273。小鼠静脉注射BNT162b2后虽可见急性心肌炎（心包炎），然而考虑到与临床给药方式的差异，此研究对mRNA疫苗导致心肌炎（心包炎）的原因探索仍然有限［50］。另一方面，mRNA疫苗过敏反应与个人的过敏史以及过敏原接触史相关［51］，过敏原包括mRNA疫苗中的PEG、与PEG结构类似的聚山梨醇酯以及常用于其他疫苗或治疗用药物的赋形剂［52-53］。由于上述2种不良反应的机制尚不明确，非临床研究中进行针对性的毒性试验与评估较为困难，主要通过临床使用前及使用后进行风险把控，如心肌炎（心包炎）发病后对症治疗及接种前对拟接种人群的过敏史进行调研等［51］。

值得一提的是，有学者认为接种SARS-CoV-2 mRNA疫苗并不会导致上述如心肌炎（心包炎）和VITT等不良反应，接种疫苗后一些不良反应的风险有某种程度的降低［54］。因此，累计更多mRNA疫苗的临床数据对于科学评估mRNA疫苗的不良反应具有重要价值。

mRNA疫苗递送至体内后，其自身会诱发细胞免疫，引起Ⅰ型干扰素升高。Ⅰ型干扰素本身即作为多种疾病的治疗靶点［55］，其升高或降低会导致人体免疫失衡。此外，Ⅰ型干扰素升高可抑制mRNA的翻译效率，从而影响mRNA疫苗预防感染的效果［56-57］。因此，mRNA疫苗在老、弱、妇、幼及免疫反应过高或过低的人群中使用的可能性和（或）剂量范围，应通过非临床和临床研究数据进行风险-收益的权衡分析。

总之，非临床和临床研究人员需及时关注相关领域的基础研究，找到合适的毒性评估手段，以降低mRNA疫苗临床应用及转化的风险，尤其是潜在的远期毒性风险。

5 加快预防用mRNA疫苗上市以应对重大突发公共卫生事件的可能性

近期肆虐全球的COVID-19疫情事件中，EMA授权mRNA疫苗BNT162b2和mRNA-1273紧急使用（Emergency Use Authorization），整个审批周期＜80 d。我国CDE建立了“研审联动，随研发随提交，随提交随审评”的审评工作机制，仅用时4个月就有4个灭活疫苗和1个重组腺病毒载体疫苗获准进入临床试验。除审评机制外，结合mRNA疫苗在技术和作用机制方面的特点，在此探讨加快审评的技术可行性。

相对传统疫苗而言，mRNA疫苗具有一个较大的技术优势，即快速研发与临床转化。基于成熟的平台技术及积累的非临床和（或）临床数据，是表征疫苗安全性的一个重要参考因素。WHO关于预防用mRNA疫苗的指导原则中提及以下情况可考虑适当缩减非临床评估过程以加快审批［17］。①对于已有临床数据的mRNA疫苗，如果只是修改靶抗原的mRNA序列而不改变疫苗的其他方面者，如LNP结构、组成比例和LNP/mRNA比例等。例如，流感病毒疫苗有可能针对变异SARS-CoV-2病毒的疫苗，如其生产工艺经批准，其非临床研究可适当减少。此类情况应尽可能收集相关疫苗的临床和非临床数据，包括已有相关的兽用疫苗，其非临床研究也有一定的参考意义。此外，非良好实验室规范（Good Laboratory Practice，GLP）条件下的组织分布研究、攻毒实验等数据也可作为参考。值得注意的是，最新研究表明，LNP的大小可能会影响疫苗的免疫原性，因此若LNP粒径发生改变，至少应评估其对免疫原性的潜在影响［58］。②基于平台技术的mRNA疫苗，若该平台其他产品（如相同递送载体的mRNA疫苗）已有夯实的、可供监管机构进行风险-收益评估的资料信息，包括非临床毒理学数据及临床试验和（或）应用的经验数据，其非临床重复给药毒性试验可与Ⅰ期临床试验同步进行。值得注意的是，如果mRNA疫苗本身针对的病原体与免疫反应相关，则靶抗原mRNA可能会导致免疫毒性增强，在非临床研究中应予以充分评价。

若mRNA疫苗由新型递送载体和新靶抗原mRNA构成，则减免非临床研究的可能性较小。但在面对重大突发公共卫生安全事件时，应充分与监管机构沟通，探讨可能快速推进临床试验的方案和策略。

6 mRNA疫苗BNT162b2和mRNA-1273的非临床研究

以下总结了目前全球已上市的针对COVID-19的2款mRNA疫苗BNT162b2和mRNA-1273的非临床试验及相关试验结果。在此需明确的是，该总结仅基于EMA官方网站公开的信息［38-39］，是否存在其他未公开的资料尚不清楚。还需强调的是，疫苗关系人民的健康安全，由于各国国情不同，mRNA疫苗研发技术平台与产业化成熟度不同，监管机构对mRNA疫苗的技术要求可能存在差异。

6.1 BNT162b2

BNT162b2于2020年12月被EMA有条件批准上市用于≥16岁人群预防感染SARS-CoV-2。BNT162b2是全球首款获批上市的mRNA疫苗，由递送载体LNP及编码全长SARS-CoV-2 S蛋白的mRNA构成，其中递送载体包含ALC-0315和ALC-0159 2种新脂质辅料。临床免疫方案为2次间隔21 d肌内注射，每人每剂30 μg。

有含2种新LNP辅料的LNP包裹替代分子荧光素酶mRNA，用大鼠研究了2种新辅料的药动学和生物分布特征。结果显示，肝为2种新辅料的主要分布器官。以Wistar Han大鼠进行重复给药毒性试验，每周1次肌内注射，共3次，毒性反应主要表现为注射部位的免疫反应（水肿和红斑），免疫细胞（中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞）增加，红细胞系轻度减少，脾、引流淋巴结和腹股沟淋巴结增大及可逆性的肝毒性。其中，肝毒性主要表现为肝细胞肿大和空泡变及谷酰转肽酶、谷草转氨酶和碱性磷酸酶水平升高，这可能与LNP在肝的分布相关；其他毒性反应与大多数mRNA疫苗相同。BNT162b2重复给药毒性试验未发现mRNA疫苗特异的毒性反应。

BNT162b2的生殖毒性试验中采用全周期设计，大鼠分别于交配前21和14 d以及妊娠第9和20天肌内注射给药，雄鼠交配结束后解剖，雌鼠于妊娠期21 d及产后21 d分批解剖。结果显示，BNT162b2对亲代生殖、胚胎-胎仔形成和子代发育均未见明显不良反应。

6.2 mRNA-1273

mRNA-1273于2021年1月由EMA有条件批准上市用于≥18岁人群预防感染SARS-CoV-2。mRNA-1273由LNP包裹编码全长SARS-CoV-2 S蛋白mRNA构成，其递送载体中包含新型辅料SM-102。临床免疫方案为2次间隔28 d肌肉注射，每人每剂100 μg。

mRNA-1273重复给药毒性试验结果表明，其毒性反应与BNT162b2基本类似。该研究虽在非GLP条件下进行，但申办方提供了其他6个GLP条件下与mRNA-1273递送载体相同、但编码抗原不同的mRNA疫苗的非临床试验数据，通过对比其毒性反应的相似性，推测mRNA-1273的毒性反应主要与递送载体相关，与编码抗原的mRNA无关。mRNA-1273的生殖毒性试验也采用全周期设计，在大鼠交配前和妊娠期间各肌内注射2次。结果显示，mRNA-1273对亲代生殖、胚胎-胎仔形成和子代发育均未见明显不良反应。

对以上资料分析可见，BNT162b2重复给药试验的给药周期（共17 d）并未完全涵盖人体的临床免疫方案（间隔21 d）；mRNA-1273的重复给药毒性试验为非GLP试验。生殖毒性试验中，未见考察mRNA本身、递送载体本身及mRNA疫苗所诱导产生的中和抗体胎盘转运及乳汁分泌的资料。此外，未见针对其中所含新型辅料的相关毒性研究，仅通过药代数据和查阅的资料说明其安全性。未见mRNA-1273单独的组织分布研究，仅以相同LNP包裹的一种巨细胞病毒糖蛋白mRNA疫苗进行了类比评价。

通过以上资料推测，在面临全球重大公共卫生事件时，BNT162b2和mRNA-1273似采用简化的非临床研究、基于已有的科学证据（疫苗本身和平台技术）加快审批及临床转化，最终实现了有条件批准紧急使用。

7 mRNA疫苗非临床研究面临的挑战和展望

随着mRNA-1273获得紧急批准使用以及BNT162b2全面批准上市，全球包括我国有越来越多的制药企业和研发机构投入该领域。我国艾博生物研发的首个国产mRNA疫苗ARCoVaX（ARCoV）Ⅰ期临床试验表明，ARCoV安全性和耐受性良好，且能够诱导强烈的体液和细胞免疫反应。此外，ARCoV较BNT162b2和mRNA-1273表现出更好的稳定性，可在2～8℃保持稳定≥6个月，这为mRNA疫苗的临床应用提供了较大的便利［59］。虽然mRNA疫苗具有较大的技术优势，但与其他类型的疫苗相比，其临床转化仍面临不小的挑战，其中一个较大的担忧是非临床研究数据外推至临床应用的局限性。不同动物种属的同类受体在结构和（或）功能上可能存在差异，因而导致疫苗在不同种属间可能存在生物活性的差异，甚至导致不同的免疫反应。其次，自身免疫反应的评价尚无较好的动物模型，导致非临床试验设计的局限性。第三，对于一类新型传染性疾病的疫苗，非临床试验结果对临床使用的剂量及免疫反应的持续时间提供的数据支持有限，疫苗临床使用的安全性和有效性更多依赖于Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ期临床试验。

在全球范围内，mRNA疫苗一直在持续地创新发展，如用含有内部核糖体进入位点序列（internal ribosome entry site）的环状RNA代替mRNA编码抗原，及以选择性内源性衣壳化的细胞递送（selective endogenous encapsidation for cellular delivery）系统为代表的新型载体等将成为下阶段的研究热点之一［60］。现有针对mRNA疫苗的指导原则并不一定适用于创新性mRNA疫苗，这势必给mRNA疫苗的非临床和临床研究带来挑战。因此，在创新型mRNA疫苗的非临床安全性评价中，应遵循逐案分析原则，在遵循GLP规范性的前提下，科学合理地开展非临床研究，更全面地提示mRNA疫苗临床应用中的潜在风险。