人肺类器官用于肺结核病研究进展及前景

钟鹏飞，保鹏涛 ，檀英霞

（1.军事科学院军事医学研究院卫生勤务与血液研究所，北京 100089；2.河北北方学院研究生院，河北 张家口 075000；3.解放军总医院第八医学中心呼吸与危重症医学科，北京 100089）

结核病是一种由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的严重威胁人类健康的传染性疾病，主要集中在东南亚、非洲和西太平洋地区，我国的结核病病例数量居世界第2位，仅次于印度。MTB可侵犯全身各器官，其中以呼吸道为主，肺结核最为常见。世界卫生组织于2014年提出了“终止结核病策略”，即2035年实现全世界范围内消灭结核病［1］，但耐药MTB的出现给该战略带来很大的挑战。目前多药耐药结核病（multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB）的发病率不断上升，且缺乏有效的治疗药物，使得患者预后不佳，严重威胁全球公共卫生安全［1］。因此，更深入地阐明MTB与宿主尤其是肺部各类型细胞（大多数肺结核发病的起始部位）的相互作用机制、开发更加经济且有效的抗结核药物迫在眉睫。

传统细胞模型和动物模型在MTB感染机制研究中广泛应用，是结核病研究的重要工具［2］。例如，人原代支气管上皮细胞用于研究MTB对支气管上皮细胞的侵染能力［3］，巨噬细胞用于研究MTB感染后MTB代谢的变化以及MTB对宿主的免疫调节等［4］。然而细胞模型细胞种类单一，缺乏与免疫调节密切相关的空间结构［5］。动物模型是研究肺结核病的有力工具，如家兔和豚鼠等，但因存在种属差异，同时由于动物不是MTB的天然宿主，动物模型只能在一定程度上模拟肉芽肿形成和肺空洞等肺结核病的病理特征［6-7］。非人灵长类动物如猕猴是研究肺部MTB感染的较理想模型，几可再现人类对MTB的所有宿主反应，但非人灵长类动物模型成本昂贵，且饱受伦理争议。事实上，MTB感染可能开始于更早的时期，这在动物模型中很难跟踪［8］。因此，亟需可以反映人体生理学和病理学特点的肺模型，这对于肺结核病致病机制研究、临床早期诊断以及抗结核新药研发均具有重要意义。

随着干细胞和发育生物学的发展，类器官（organoids）的出现为人们提供了一种全新的体外研究模型，可实现体外再现体内源组织器官的关键结构和功能特性［9］。本文对人肺类器官的构建、在肺结核病研究中的进展及其潜在的应用前景等进行综述。

1 类器官概述

类器官是一种衍生于多能干细胞（pluripotent stem cells，PSC）或成体干细胞体外3D培养构建的多细胞团［12］，其中PSC包括体细胞重编程而来的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）［13］和胚胎干细胞［14］，而成体干细胞衍生的类器官可取自手术或活检的健康或肿瘤组织。与传统的细胞模型相比，类器官具有更加接近生理状态的细胞类型和行为，并且保持着遗传稳定性及可扩增性，研究数据更能代表人体内细胞真实的生理反应过程［10-11］。相对于动物模型，类器官的关键优势是其为人类干细胞的衍生物，反映的是人体生理反应，而不是“类人”反应，更能准确地反映致病菌对人体的感染过程。因此，类器官弥补了传统的细胞模型和动物模型的不足，研究数据能更好地转化应用至人类本身，其中人肺类器官是研究呼吸系统疾病特别是肺结核病的一个独特的模型。

2009年，Clevers团队利用肠道隐窝基底处的富含亮氨酸重复序列G蛋白偶联受体5+（leucinerich repeat-containing G protein-coupled receptor 5+）肠道干细胞培育出世界上首个微型肠道类器官［15］。自此以后，类器官技术在人类科学研究发展史中拉开了帷幕，并迅速成为新的研究热点，备受生物学界和临床医学研究领域的关注。目前3D类器官培养技术已成功培养出大量具有部分关键生理结构和功能的类组织器官，如肾［16］、肝［17］、肺［18］、脑［19］、胰腺［20］和视网膜［21］等。除形态还原度高外，类器官还具有可扩增和基因组稳定的特性，因而可使用与原代细胞相同的研究技术，如荧光标记、活细胞成像、电子显微镜、质谱和基因操作（如CRISPR-Cas9）等进行研究［22-23］，特别适合于生物学研究领域。现已广泛应用于包括发育生物学［24］、疾病模型［25］、药物筛选［26］和再生医学［27］等研究。

2 人肺类器官的构建

肺起源于胚胎发育时的腹侧前肠内胚层，其发育的不同阶段受各种信号通路如Wnt、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）和转化生长因子β信号通路等紧密协调和调控，诱导分化的主要步骤包括内胚层、前肠球体形成和近、远端肺上皮细胞的分化［28］。源于人PSC诱导分化获得的人肺类器官方案为：首先通过激活素A（activin A）的作用促使人PSC向内胚层分化，然后在FGF-4和Wnt信号通路激动剂CHIR-99021等因子作用下形成前肠内胚层，之后再加入一定浓度的FGF-10进一步培养诱导为人肺类器官［18］。此外，人肺类器官也可从临床穿刺或切除的肺组织中分离的气道基底细胞、棒状（Club）细胞或Ⅱ型肺泡上皮细胞等分化而来［29-30］。

3 人肺类器官在肺结核病研究中的应用及前景

体外人体类器官是研究疾病病原学和病原体与宿主相互作用的独特模型系统。目前，人PSC和组织来源的人肺类器官已成为研究多种呼吸道感染性疾病的有力工具，如隐孢子虫［31］、铜绿假单胞菌［32］、呼吸道合胞病毒［33］、流感病毒［34］和新型冠状病毒（SARS-CoV-2）［35］等感染性疾病，提示人肺类器官能够极大地促进对呼吸道感染性疾病相关机制的研究。

3.1 在肺结核病研究中的应用

目前人肺类器官已用于模拟MTB感染及产生的炎症应答，再现人体组织被MTB感染后产生的病理变化和免疫反应，从而为临床治疗提供参考。许多研究结果已表明，MTB主要通过侵入肺泡巨噬细胞并在吞噬体内复制引起原发性肺部感染。但也有学者认为，MTB可通过其他途径，如通过入侵肺泡上皮细胞［36］、黏膜相关淋巴组织［37］或微褶细胞［38］触发局部炎症反应，释放的趋化因子可募集各类免疫细胞并在此形成肉芽肿。Iakobachvili等［39］用显微注射的方法将MTB注射至含有基底细胞、纤毛细胞和杯状细胞的人细支气管类器官管腔中探索感染的早期事件，发现MTB对上皮细胞的低嗜性；他们进一步分析肺类器官炎症因子的表达水平，发现白细胞介素8（interleukin-8，IL-8）和β-防御素1（βdefensin-1）在上皮细胞的表达显著增加，有利于免疫细胞趋化并控制感染。此外，与气道分泌物产生有关的黏蛋白5B（mucin 5 subtype B）和黏蛋白4等基因的表达均显著降低，这可能有利于MTB在气道中定植，但影响黏蛋白表达的具体机制还有待阐明。该研究通过气道类器官在3D水平上揭示了感染早期MTB在宿主体内的适应性、细胞嗜性和宿主反应，同时也揭开了肺结核病体外研究的新篇章。

目前人肺类器官用于肺结核病研究的相关报道较少，期待更多的研究者使用人肺类器官这一独特模型，进一步探索MTB的感染机制及其在宿主体内的进化、蛰伏和复苏过程，从而为研发更多有潜力的抗肺结核病药物或疫苗提供数据支撑。

3.2 在肺结核病研究中的应用前景

尽管当前人肺类器官用于肺结核病的研究刚刚起步，但它已广泛应用于其他呼吸道感染性疾病的研究并取得很大进展。由此提示，该模型在构建肉芽肿模型、肺结核病机制研究、共病研究及抗结核药物筛选等方面亦可能具有很好的应用前景，值得进一步探索。

3.2.1 构建肉芽肿模型

如前所述，肉芽肿组织是结核病典型的病理标志，其形成与MTB的上皮细胞相互作用有关［40］。作为控制MTB复制的关键结构，其同样也可能成为促进病原体复制的“温床”［41］。MTB在该结构内的存活状态（休眠和复苏等）代表了结核病的关键阶段。已有研究表明，MTB在生存压力下，通过上调三酰基甘油合酶1基因表达，从宿主细胞中获取甘油三酯作为能量来源，进入休眠和耐药状态［42］。然而尚不明确MTB表达何种基因产物促进了宿主释放甘油三酯，这种基因产物可能成为对抗休眠状态并发展为耐药性病原体的新药靶标。因此，需要建立包含人类宿主细胞的体外肉芽肿模型进行观察和验证［43］，以研制新的针对性治疗药物。

目前，已通过多种方法建立了体外肉芽肿模型，如人外周血单核细胞肉芽肿模型［44］、胶原蛋白基质模型［45］、多细胞肺组织模型［46］和生物电喷雾3D模型［47］，阐明了部分免疫机制，然而上述模型有的过于简单，缺乏其他的宿主细胞类型和细胞外基质；有的又过于复杂且通量低，限制了其进一步应用。人肺类器官不仅包含多种类型的人肺细胞，其培养过程也需要细胞外基质，符合肉芽肿的形成条件。若将免疫细胞与人肺类器官共培养，引入MTB感染人肺类器官后建立体外肉芽肿模型，比现有体外肺结核模型更具有代表性，更有助于探索肺结核病的发病机制。

3.2.2 与其他先进技术结合用于肺结核病机制研究

由于体外模型可操作程度高，将肺类器官与其他先进技术结合可能产生1+1＞2的效果。CRISPRCas9系统是一种功能强大的基因编辑工具，可与人肺类器官高效结合。一方面，它可对MTB进行基因编辑，如敲除MTB上某药物潜在靶点，在人肺类器官疾病模型上验证该药物的效果［48］；另一方面，它也可对类器官进行基因编辑，基因编辑后的类器官可用于验证该基因对于MTB感染的必要性，并找到相应治疗靶点。类器官结合数学和计算模型实现跨学科应用，可轻松实现疾病模型数据收集并进一步改良，以用于快速且高效筛选干预措施［49］。

单细胞测序（single-cell sequencing）技术作为一种当今最为先进的组学技术之一，可用于研究细胞异质性。例如，Han等［35］通过单细胞测序技术对感染SARS-CoV-2后的肺类器官细胞群进行鉴定，其中特异表达血管紧张素转换酶2的肺泡Ⅱ型上皮细胞能够被SARS-CoV-2感染，并由此进一步筛选了多种血管紧张素转换酶2的抑制剂，有望成为新型冠状病毒感染肺炎（COVID-19）治疗的新策略。可见，单细胞测序技术与人肺类器官结合，有利于对MTB与人类宿主的相互作用机制进行深度探索。

3.2.3 共病研究

结核病的发展与许多个体因素有关，如糖尿病、人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）合并感染、吸烟和酗酒等［50］。糖尿病是活动性和潜伏性肺结核发病的主要危险因素，导致患者对结核病易感性增加［51］；HIV合并感染也是发生活动性结核病的重要风险因素，增加了原发性感染或再感染的易感性［52］。共感染的病原体之间相互促进或抑制的程度取决于其共同感染的物种，而物种间的种属差异性导致病情的严重程度不同，进而对治疗决策产生干扰［53］。而使用来自不同个体（不同遗传背景及合并症的潜在感染者）的成体干细胞衍生的肺类器官，是开展结核病与其他疾病共病机制研究的极佳平台。个体化人肺类器官可对MTB与宿主的相互作用进行深刻剖析，从而为个体化治疗开辟新途径［2］。此外，人iPSC衍生的肺类器官依然能够保留源个体的特征，如遗传多样性、年龄、代谢状态和突变标志等［54-55］。因此，将某个患者的iPSC衍生的肺类器官和免疫细胞共培养搭建的肺结核模型，能够最大程度地反映具有个体特点的病原体与宿主相互作用和治疗的差异性，成为开发呼吸道感染性疾病个性化治疗方法的有力工具。

3.2.4 抗结核药物筛选

抗结核药物敏感性试验对结核病治疗至关重要，传统药物测试模型主要使用细胞系和动物模型，但两者在研究MTB感染时有许多局限性。而类器官在非临床药物筛查研究方面具备高通量、高特异性的特点［9］，如人肠道类器官用于抗轮状病毒药物测试，其有效剂量范围相比细胞模型与人体测试结果更加接近［56］。此外，据美国食品药品监督管理局调查数据显示，即使经过动物实验检测确认安全有效后，仍有高达90%的药物在临床人体试验中宣布失败，而失败的原因主要是缺乏与预期相符的疗效或具有毒性［57］。因此，构建能够直接预测人类反应的模型系统非常重要，可显著减少新药研发的时间和成本。基于人肺类器官建立的肺结核模型，将弥补传统细胞和动物模型的缺陷，为有效筛选抗结核药物尤其是针对耐药菌的抗结核药物筛选提供新平台。

4 面临的挑战

如上所述，人肺类器官在肺结核病发病机制、耐药机制和共病研究及抗结核药物筛选等方面具有巨大的潜力，但同样也具有其局限性：①目前构建的人肺类器官包含多种肺上皮细胞类型，缺乏内皮细胞、平滑肌细胞和免疫细胞及血液循环，无法重现微环境对感染发生和进展的影响［26］。器官芯片（organ on-chip）技术可以实现免疫细胞迁移和血液流动，模拟气-液-黏膜界面并再现MTB感染宿主的过程及关键病理生理特征，具有更好的临床一致性［58］。②人肺类器官的培养缺乏标准化方案，从而影响了其在感染性疾病研究中的效果。如使用化学成分不明确或力学结构过于单一的细胞外基质可能会影响细胞行为，包括生长、增殖、迁移和分化等，从而有可能干扰肺结核病机制研究和抗结核药物高通量筛选的结果［59］。科研人员已经在尝试开发一些含有特定的生物物理和生化特性的人工合成基质，用以取代各种生物来源的细胞外基质［60］。构建完善的人肺类器官将有助于更加客观地认识肺结核病的发病机制，成为抗结核药物开发的高质量平台，为实现“终止结核病”的目标发挥突出作用。