细胞初级纤毛在骨代谢中的作用及机制研究进展

胡小江 张宏其 郭超峰 唐明星 刘少华 李艳冰 张广 李石磊 李韬 高琪乐*

1.中南大学湘雅医院脊柱外科和骨科，湖南 长沙 410008 2.中南大学湘雅医院检验科，湖南 长沙 410008

1 初级纤毛与骨质疏松

初级纤毛是细胞表面的一种以微管为基础的纤细的细胞器，存在于单细胞真核生物和人类等脊椎动物的细胞中[1]。纤毛与质膜之间有连续的膜将其连接在一起，但纤毛由独特的脂质和受体组成，使纤毛能够检测细胞外环境的变化，并向细胞传递信号，以调节细胞的多种生理过程。因此，原发性纤毛功能障碍会导致一组称为纤毛病的综合性疾病，在胚胎发育及个体生长中会影响许多不同的器官和系统，与其相关疾病包括肥胖、心血管和肾脏疾病、听力和视力丧失，甚至癌症等。目前，在这个领域内研究较广泛的疾病为肾囊肿、肝囊肿以及骨质疏松[2-3]。

骨质疏松症是一种因为骨量减低、骨组织微结构退化导致骨骼脆性增加的全身性骨骼疾病，通常会引起骨折风险增加，是老年人骨折最常见的原因[4]。最新的研究表明，妇女绝经后体内雌激素缺乏引起的骨质疏松与骨细胞初级纤毛结构的破坏紧密相关[5-6]。初级纤毛与骨质疏松、骨代谢之间存在密切的联系[7-10]。

2 初级纤毛调节骨代谢的相关信号通路

初级纤毛是许多信号通路的信号传导中枢，例如酪氨酸激酶受体(RTK)、转化生长因子-β(TGF-β)通路、G蛋白偶联受体(GPCRs)、Hedgehog/(Wnt)通路、Notch通路等，同时初级纤毛也是雷帕霉素的机制靶点(mTOR)[11]。以上通路均参与了机体骨代谢过程，现将研究较多的通路分述如下。

2.1 Hedgehog信号通路

Hedgehog信号通路是最早被发现的与初级纤毛信号传导相关的通路，具有调节细胞增值分化和凋亡的功能[12]。研究发现，绝经后雌激素缺乏导致的骨质疏松与初级纤毛和Hedgehog信号通路有关：雌激素撤退导致骨细胞表面的初级纤毛伸长，从而引起骨细胞中Hedgehog信号通路的表达增加。骨细胞的Hedgehog信号可以通过增加RANKL/OPG等信号促进破骨细胞的生成[5]。最新的研究发现了存在于初级纤毛中的成骨细胞Hedgehog通路的负性调控因子SLITRK5，在细胞实验中，成骨细胞SLITRK5的缺失导致Hedgehog信号通路的表达上调，而SLITRK5的过表达则会抑制Hedgehog信号通路的表达。其机制是Hedgehog通路的表达可以使细胞上初级纤毛数量增多，而SLITRK5是Hedgehog通路的负性调控因子，其低表达或者缺失会使Hedgehog通路表达上调[13]。

2.2 WNT信号通路

Wnt信号在间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的维持和分化中起着至关重要的作用。由Wnt控制的信号通路可分为典型(β-连环蛋白通路)和非典型(平面细胞极性和Wnt/Ca2+通路)两类，依赖于β-连环蛋白稳定的Wnt通路被称为WNT/β-连环蛋白通路，具有调节干细胞的增值和分化的作用[11]。但对于这个领域的研究一直以来存在很多矛盾和分歧：Corbit等[14]在2008年的研究结果显示原发性纤毛缺失或破坏可导致WNT/β-连环蛋白通路活性上调；Bernatik等[15]在2021年的研究发现，在使用WNT激活剂(WNT3a)激活该通路条件下细胞初级纤毛的数量、长度相对于阻断该通路的细胞初级纤毛无明显差异，这表明WNT/β-连环蛋白通路的上调对初级纤毛形成没有明显作用。Bernatik等[15]的研究与之前研究结果的差异可能的原因有几个方面：①此研究是使用新型的重组WNT3a激活了WNT/β-连环蛋白通路，而之前的研究中经常使用的是WNT3a条件培养基。WNT/β-连环蛋白通路的完全激活、初级纤毛形成通常发生在适当刺激后的几个小时内，而细胞在WNT3a条件培养基中培养需较长时间，而此研究均在72 h内完成。②一些文献报道的纤毛长度或厚度的变化实际上是通过乙酰化α-微管蛋白抗体染色观察纤毛微管蛋白乙酰化的变化，现有证据表明纤毛微管蛋白在纤毛各个部位的表达具有显著差异，不能准确测定纤毛的长度，而Bernatik等[15]是通过对Arl13b染色来观察纤毛，Arl13b是一种来自Arf/Arl家族的小GTP酶，在纤毛膜中高度富集，可用于直接测定的纤毛的大小。虽然WNT通路对于初级纤毛不具有调节作用，但大量研究表明，初级纤毛对WNT通路具有显著的调控作用[16-17]。

2.3 TGF-β信号通路

转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β超家族有几十个成员，其中比较常见的包括TGF-β1/2/3、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMP)，它们都具有相同结构——一个疏水信号序列、一个结构域和一个成熟的C末端结构域。这个超家族所有成员对细胞的增值分化和胚胎发育都具有重要作用[18]。

MSCs的募集是组织发育、维持和修复的关键过程。TGF-β是一种有效的趋化因子，对骨髓间充质干细胞(BMSCs)的募集至关重要，在干细胞增殖和分化中起着关键作用。初级纤毛是BMSCs中TGF-β信号通路激活所必需的，根据免疫荧光结果表明，TGF-β受体、SMAD2、SMAD3和SMAD4都主要定位于BMSCs的初级纤毛，进一步的实验验证了这一结果。人为敲低调控纤毛产生的基因IFT88后可见纤毛长度变小的同时磷酸化SMAD2/3的水平也显著降低。另外，IFT88基因敲低后BMSCs的迁徙能力降低，表明初级纤毛在骨骼疾病的发生机制中具有关键作用[19]。对于成骨细胞来说，现有的研究结果表明，TGF-β1通过HDAC6基因介导初级纤毛缩短和变形以及纤毛数量的减少；TGF-β通过失活骨形态发生蛋白BMP2和BMP7(诱导成骨细胞分化的主要蛋白)抑制成骨细胞的成熟和分化[20]。在另外的研究中表明，TGF-β对于纤毛的抑制作用是通过抑制IFT88基因的表达来实现的[21]。总之，TGF-β对于骨代谢的影响呈现两面性，一方面通过激活BMSCs初级纤毛中的TGF-β/SMAD信号通路促进BMSCs的募集从而促进成骨，另一方面通过调控各基因的表达使初级纤毛变形、减少、功能减退，从而使得成骨细胞成骨分化受到抑制。对于TGF-β在成骨方面的两面性目前尚未研究透彻，这也是目前骨代谢方面研究的重点方向。

此外，最新的文献报道了中心粒附属器蛋白CEP128，CEP128的缺失可在不影响初级纤毛结构和数量的基础上导致斑马鱼细胞的初级纤毛中TGF-β/骨形态发生蛋白(BMP)信号通路功能受损，原因可能与纤毛上部分囊泡转运缺陷有关[22]。因此CEP128可能会成为初级纤毛研究的新方向。

3 初级纤毛基因水平的调控对骨代谢的影响

3.1 IFT80

纤毛内转运蛋白(IFT)是一系列维持纤毛结构和功能的蛋白。IFT以及调节的基因的缺失将会导致纤毛结构的破坏和功能缺失。Liu等[23]在对小鼠的动物实验中，利用他莫昔芬(tamoxifen)诱导构建条件敲除IFT80的小鼠股骨骨折模型，与对照组相比，实验组小鼠骨折愈合处骨体积、骨小梁数量和骨小梁厚度显著降低，骨小梁间距更大。与对照组小鼠相比，骨细胞中IFT80的缺失导致骨折骨痂中纤毛形成受损和软骨细胞增殖减慢。在对于椎间盘退变的机制研究中表明，IFT80的缺失导致椎间盘细胞凋亡显著增加，并显著降低软骨形成标志物(Ⅱ型胶原蛋白、SOX9、蛋白聚糖和Hedgehog信号成分等)的表达，IFT80对于维持椎间盘细胞组织结构和功能具有重大作用。

3.2 IFT88

IFT88是纤毛内转运复合物B的中心成分，对于纤毛的构建至关重要。前述已提到IFT88基因调控纤毛的产生和其功能的发挥，且这一过程与TGF-β有关。需要注意的是，IFT88缺失能够显著减弱细胞的迁徙能力，但关于IFT88如何影响细胞迁徙的机制还需要在后续的研究中进一步深入探讨[24]。直到2020年Lee等[25]的研究表明，骨桥蛋白(OPN)是 BMSCs 向骨重塑部位迁移的重要化学引诱剂。初级纤毛的缺失减少了 OPN 介导的 BMSCs 迁移，初级纤毛作为 OPN 的化学引诱物传感器，不仅通过控制 CD44 介导的 OPN 信号传导，还通过控制Cdc42介导的肌动蛋白细胞骨架重排来调节BMSCs迁移。

3.3 KIF3A

顺行纤毛内转运运动蛋白KIF3A可调节初级纤毛的完整性和各种细胞功能。Jiang等[26]研究表明，KIF3A在人牙髓细胞中的表达被敲低后，导致初级纤毛数量显著减少，从而导致大量成骨分化相关标志物的表达受损，Wnt3a/β-catenin的表达水平减弱。由于KIF3A完全不表达的小鼠胚胎无法继续发育，因此，Qiu等[27]的研究中建立了以骨钙素(Oc)-Cre介导小鼠部分KIF3A的条件性缺失的模型，成骨细胞中Oc-Cre介导小鼠KIF3A的条件性缺失减少了初级纤毛的产生和功能，并通过多种途径损害成骨细胞介导的骨形成，包括骨钙素减少、Hedgehog介导的Gli2表达减少、Wnt3a介导的β-连环蛋白和Axin2表达减弱。

4 初级纤毛调节BMSCs成骨分化

骨髓间充质干细胞是研究最广泛的成骨细胞祖细胞来源，它在体外可以根据生物物理信号进行成骨细胞分化，这些生物物理信号包括生理循环静水压、流体流动产生的剪切应力、骨基质形变和刚度和电磁场等，初级纤毛在BMSCs在生物物理信号的接受和传递中具有重大作用。此外，机械刺激也能增加骨细胞和成骨细胞上初级纤毛的数量，且能通过骨细胞和成骨细胞中的初级纤毛依赖性和 Gli-1 依赖性途径调节成骨反应[28]。骨细胞上的初级纤毛比BMSCs上的纤毛更容易感受到微弱的机械刺激[29]。

机械敏感钙通道瞬时受体电位亚家族第四成员(TRPV4)在BMSCs中主要表达在初级纤毛上。使用TRPV4特异性拮抗剂GSK205拮抗TRPV4会导致BMSCs中振荡流体剪切诱导的钙信号完全丧失；使用TRPV4特异性激动剂GSK101可以诱导产生与振荡流体剪切力诱导的信号相似的钙信号，TRPV4特异性激动剂GSK101对于骨代谢疾病应用的研究尚未见报道[30]。

BMSCs机械传导的信号通路利用cAMP作为第二信使，这个第二信使是通过位于BMSC初级纤毛中的腺苷酸环化酶-6(AC-6)激活，这种机械传导机制被证明可以作为治疗靶点，cAMP信号可通过AC激活剂进行生物化学激活，来增强cAMP信号和早期成骨信号，是一种潜在的治疗骨质疏松等疾病的方法[31]。

对骨骼的机械刺激是骨骼密度维持和结构稳定所必需的，其刺激可通过BMSCs、骨细胞、成骨细胞等细胞表面的初级纤毛所感受；BMSCs是成骨细胞的前体细胞，BMSCs功能的发挥与成骨密切相关[32]。以下将介绍3个研究较多的骨骼物理刺激信号，以总结BMSCs初级纤毛成骨的相关研究方法。

4.1 低强度机械刺激

Curtis等[33]发现，低强度机械刺激(LMMS)诱导的成骨与BMSCs密切相关。Coughlin等[34]使用生物反应器对小梁骨块进行低强度机械刺激(以0.3×g的LMMS在30 Hz下刺激骨小梁体外骨块)，结果表明从机械刺激组中获取的BMSCs比对照组的BMSCs增值能力更强，而通过水合氯醛破坏细胞表面的初级纤毛后，发现两组细胞的增值能力没有显著差异，这证明LMMS能促进成骨，且其成骨的促进作用与BMSCs表面的初级纤毛密切相关。

4.2 流体剪切应力

流体剪切应力在BMSCs中诱导成骨反应。其作用的应力大小、频率和持续时间不同，诱导的成骨反应效力也不同。Chi等[35]通过测定短期流体流动刺激后成骨标志物Cox2、Runx2和OPN的mRNA表达，确定了在体外细胞实验中BMSCs在2 Pa剪切幅度和2 Hz频率的流体剪切应力下成骨基因的表达最稳定且较显著上升。有足够证据表明流体剪切应力信号是由BMSCs表面的初级纤毛接受并传递的，且这一效应是由TRPV4介导的[30]。

4.3 脉冲电磁场

脉冲电磁场(pulsed electromagnetic fields，PEMFs)是预防和治疗骨质疏松症的潜在治疗方法，之前的研究结果表明，PEMFs通过激活骨形态发生蛋白BMP-Smad1/5/8信号，促进大鼠颅骨成骨细胞的成骨分化和成熟。PEMFs通过初级纤毛介导的BMP受体Ⅱ(BMPRⅡ)表达上调和随后BMP-Smad1/5/8信号的激活，刺激成骨细胞的成骨分化和成熟[36]。最新的研究表明，极低频脉冲电磁场(16 Hz)也增强了BMSCs细胞的TGF-β信号传导，增加Smad2、3和7表达[37]。其他研究表明，脉冲电磁场也通过初级纤毛介导的COX2-PGE2通路信号传导和EP4表达促进成骨[38]、通过成骨细胞表面的初级纤毛激活PI3K/AKT信号通路，进而促进骨形成活性和分化[39]。

5 临床应用

近来，对初级纤毛和骨代谢的相关研究逐年增多，但对于其临床应用转化的研究才刚刚起步。目前，治疗骨质疏松症的新方向是通过靶向诱导成骨细胞及MSCs成骨分化，进而促进骨形成。在此过程中调控初级纤毛功能可作为靶向治疗骨质疏松的一种潜在治疗方式。例如，上文中提及的腺苷酸环化酶(AC)激动剂激活cAMP信号模拟机械刺激诱导成骨反应；TRPV4特异性激动剂GSK101可能用于模拟机械负荷的成骨作用；以及脉冲电磁场作用下的成骨诱导等都是致力于寻找初级纤毛靶向治疗的可能性与可行性。

另外，药物研究表明，氯化锂(LiCl)和非诺多泮(fenoldopam)两种药物都增强了BMSCs表面的纤毛的数量和长度。且BMSCs的机械敏感性增加，导致成骨基因的表达上调，但较长时间使用氯化锂会导致细胞活性的降低，所以氯化锂不能用于纤毛的靶向治疗；而非诺多泮在其使用的早期对于成骨是起到促进作用，而长时间的应用下并未发现其显著的促进成骨作用，因此，非诺多泮调控初级纤毛靶向治疗骨质疏松更具备可行性HEDGEHOG[40]。纤毛靶向药物机制的研究尚刚起步，其临床应用尚无报道，在未来，纤毛靶向药物的前景如何还需要进一步探索。

综上所述，对于初级纤毛的研究目前已有了较为深入的认识，尤其是其形态、功能的研究，以及基因调控方面的研究均已经比较完善。目前对初级纤毛的体外模型、体内模型的构建均有了一定程度的认识[41]。但是，初级纤毛功能的具体机制研究尚有分歧，尤其是初级纤毛通路的机制研究尚未完全明确；此外，对于初级纤毛临床应用研究，尤其是骨质疏松方面的纤毛靶向治疗也刚刚起步，但其可行性与运用前景仍然十分良好，可为骨质疏松的治疗提供新的方向。