miR-369-3p通过靶向调控DYRK1A对乳腺癌MDA-MB-231细胞放疗敏感性的影响

万江花 尤晓光 苏兰芳 刘旭东 林娟 邓丹琼

(海南医学院第一附属医院放射科，海南 海口 570102)

乳腺癌属女性常见恶性肿瘤，发病率高，是导致女性癌症患者死亡的主要原因，其中三阴性乳腺癌占乳腺癌的20%左右，相较于其他类型预后更差、转移率更高，目前治疗以化疗或辅助化疗为主〔1，2〕。化疗后患者化疗敏感性降低，可能出现预后较差、复发等严重现象，化疗后中位生存时间约1年〔3〕，因此寻找新辅助化疗方法从而提高化疗敏感性对于疾病治疗意义重大。微小RNA(miRNA)在改善化疗敏感性中逐渐被发现，miRNA通过介导内源性或外源性凋亡通路蛋白从而影响化疗敏感性〔4〕，其中miR-369-3p在大肠癌中靶向双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶(DYRK)1A可调节放疗敏感性，而DYRK1A影响细胞凋亡〔5〕。但乳腺癌中并未发现相关研究报道。本研究以三阴性乳腺癌MDA-MB-231为研究对象，检测miR-369-3p对细胞放疗敏感性的影响，为辅助乳腺癌化疗提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1细胞 人乳腺癌MDA-MB-231购自中国科学院上海细胞库，目录号：TCHu227。

1.2主要试剂与仪器 L-15培养基、胎牛血清(FBS)购于美国GIBIO公司，货号分别为：41300039、10099-141；逆转录试剂盒(美国Ambion公司，货号：AM1552)；荧光定量PCR试剂盒(日本TaKaRa公司，货号：ARR041A)；CCK-8试剂盒、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)细胞凋亡检测试剂盒(碧云天生物科技有限公司，货号分别为：C0039、C1062M)；一抗DYRK1A(兔抗)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)3(兔抗)、caspase9(兔抗)、内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GADPH，兔抗)、羊抗人二抗(美国Abcam公司，货号分别为：ab65220、ab181602、ab32539、ab32539、ab97051)；引物由上海生工生物公司合成；miR-369-3p mimic、miR-369-3p mimic NC、miR-369-3p inhibitor、miR-369-3p inhibitor NC、Lipofectamine 2000均购自上海吉玛公司。

CO2培养箱(德国WIGGENS公司，型号：WCI-180)；实时荧光定量PCR(qRT-PCR)仪(美国ABI公司，型号：7500)；Varian 2100直线加速器(美国Ohio公司，型号：Clinac-2100C/D)；酶标仪(美国BIO-RAD公司，型号：550)；流式细胞仪(美国Thermo Fisher公司，型号：Attune NxT)；蛋白凝胶成像仪(上海天能科技有限公司，型号：5200)。

1.3细胞培养和处理 细胞培养：L-15培养基中加10%FBS制成L-15完全培养基，4℃冰箱保存待用。MDA-MB-231，75%酒精消毒培养瓶后立即置于37℃ CO2培养箱中培养，观察细胞形态，第2天分离出部分细胞置于L-15完全培养基中培养待用，培养瓶中细胞继续培养保种。实验细胞传2～3代后收集对数生长期细胞进行下一步研究。

细胞处理：生长良好的MDA-MB-231稀释成1×105个/ml，24孔板中添加500 μl稀释液，待细胞密度达60%时，吸出旧培养液进行转染。1 μl Lipofectamine 2000与50 μl L-15培养基混匀，室温孵育5 min；2 μl(miR-369-3p mimic、miR-369-3p mimic NC、miR-369-3p inhibitor、miR-369-3p inhibitor NC)分别与50 μl L-15培养基混匀，室温孵育5 min。上述两混合液1∶1混匀后，室温放置15 min。miR-369-3p mimic组、miR-369-3p mimic NC组、miR-369-3p inhibitor组、miR-369-3p inhibitor NC组分别添加500 μl对应混合液，对照组只添加MDA-MB-231细胞换新的L-15培养基对照处理。轻轻摇板混匀，37℃ CO2培养箱中培养6 h，换成L-15完全培养基继续培养。

1.4qRT-PCR检测细胞中miR-369-3p水平1.4.1细胞培养至细胞密度90%左右时，检测细胞中miR-369-3p的表达水平。每个孔中加1 ml Trizol裂解细胞，部分并提总RNA，采用逆转录试剂盒将总RNA合成cDNA，qRT-PCR仪对miR-369-3p、内参U6扩增。引物序列 miR-369-3p正义链：5′-TGGGAATAATACATGGTTGATC-3′、反义链：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；U6正义链：5′-TGCTGGGGCTTTCCGGCAGCGC-3′、反义链：5′-CCCAGTGAGGTCCGGAGGT-3′。上样体系20 μl：2×荧光定量PCR试剂(10 μl)、cDNA(1 μl)，正义链/反义链(10 μmol/L)各0.5 μl，ddH2O(8 μl)。反应条件：95℃、5 min；95℃、60 s，62℃、45 s，45个循环。2-ΔΔCt法计算细胞中miR-369-3p水平。

1.4.2CCK-8法检测细胞增殖能力 细胞接种至96孔板(5.0×104个/孔)，L-15完全培养基为空白对照，每孔100 μl，6个重复。Varian 2100直线加速器6 MV X线为放射源(剂量率400 cGy/min、照射野100 mm×100 mm)照射MDA-MB-231，剂量用计算机治疗系统进行调整，包括2、4、6、8 Gy 4个计量点绘制剂量存活曲线，每个计量点照射完成时间1～2 min。照射完成后置CO2培养箱中继续培养48 h，加入CCK-8试剂继续培养2 h，酶标仪检测450 nm下各孔细胞光密度(OD)，OD450=实验孔OD450-空白对照孔OD450。存活率=〔OD450-0 Gy-OD450-(2、4、6、8)Gy〕/OD450-0 Gy×100%。

1.4.3流式细胞仪检测细胞凋亡 0、6 Gy照射检测细胞凋亡情况，1.4.1各组细胞每孔2×105个细胞接种于6孔板中，细胞过夜后贴壁，按1.4.2操作6 Gy照射，继续培养48 h，胰酶消化处理各组细胞，各组细胞浓度调整为1×106个，加入Annexin V-FITC和PI试剂，混匀避光15 min，1 h内流式细胞仪上机检测。

1.4.4Western印迹检测细胞中DYRK1A、caspase3、caspase9蛋白表达情况 0、6 Gy照射检测细胞中DYRK1A蛋白的表达情况，按1.4.2操作6 Gy照射细胞，裂解细胞，部分3 000 r/min 4℃离心20 min，取上清检测DYRK1A蛋白水平。BCA试剂盒测定每个样本中蛋白总浓度，补ddH2O使每孔总蛋白浓度相同。每孔上样30 ng，聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离蛋白质，280 mA转膜；5%脱脂奶粉室温封闭2 h；对应加入一抗DYRK1A(1∶1 000)、caspase3(1∶2 000)、caspase9(1∶5 000)、GADPH(1∶5 000)，4℃孵育过夜；对应加入二抗，室温孵育1 h。二氨基联苯胺(DAB)显色试剂显色，蛋白凝胶成像仪拍照和定量分析。

1.5统计学分析 采用SPSS25.0进行单因素方差分析、SNK-q检验。Targetscan预测DYRK1A基因与miR-369-3p结合位点。

2 结 果

2.1各组细胞中miR-369-3p水平比较 分别与对照组、miR-369-3p mimic NC组、miR-369-3p inhibitor NC组相比，miR-369-3p mimic组细胞中miR-369-3p水平显著升高(P<0.05)，miR-369-3p inhibitor组细胞中miR-369-3p水平显著降低(P<0.05)。与miR-369-3p mimic组相比，miR-369-3p inhibitor组细胞中miR-369-3p水平显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组miR-369-3p水平、细胞凋亡率及DYRK1A蛋白表达比较

2.2miR-369-3p对MDA-MB-231细胞放疗敏感性的影响 分别与对照组、miR-369-3p mimic NC组、miR-369-3p inhibitor NC组相比，0、2、4、6、8 Gy中miR-369-3p mimic组存活率均显著降低(P<0.05)，miR-369-3p inhibitor组存活率均显著升高(P<0.05)。随着X线照射剂量升高，对照组、miR-369-3p mimic NC组、miR-369-3p inhibitor NC组、miR-369-3p mimic组、miR-369-3p inhibitor组细胞存活率显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 miR-369-3p对MDA-MB-231不同剂量X线照射的存活率

2.3流式细胞仪检测细胞凋亡结果 在0、6 Gy中，分别与对照组、miR-369-3p mimic NC组、miR-369-3p inhibitor NC组相比，miR-369-3p mimic组凋亡率显著升高(P<0.05)，miR-369-3p inhibitor组凋亡率显著降低(P<0.05)。与0 Gy相比，6 Gy照射下对照组、miR-369-3p mimic NC组、miR-369-3p inhibitor NC组、miR-369-3p mimic组、miR-369-3p inhibitor组均凋亡率显著升高(P<0.05)。见表1、图1。

1～5：对照组、miR-369-3p mimic NC组、miR-369-3p inhibitor NC组、miR-369-3p mimic组、miR-369-3p inhibitor组；图2、3同

2.4各细胞中DYRK1A蛋白表达的比较 在0、6 Gy中，分别与对照组、miR-369-3p mimic NC组、miR-369-3p inhibitor NC组相比，miR-369-3p mimic组DYRK1A蛋白水平显著降低(P<0.05)，miR-369-3p inhibitor组DYRK1A蛋白水平显著升高(P<0.05)。与0 Gy相比，6 Gy照射下对照组、miR-369-3p mimic NC组、miR-369-3p inhibitor NC组、miR-369-3p mimic组、miR-369-3p inhibitor组DYRK1A蛋白水平显著降低(P<0.05)。见表1、图2。

图2 Western印迹检测细胞中DYRK1A蛋白表达情况

2.5各组细胞中caspase3、caspase9蛋白表达比较 在0、6 Gy中，分别与对照组、miR-369-3p mimicNC组、miR-369-3p inhibitor NC组相比，miR-369-3p mimic组caspase3、caspase9蛋白水平显著升高(P<0.05)，miR-369-3p inhibitor组caspase3、caspase9蛋白水平显著降低(P<0.05)。与0 Gy相比，6 Gy照射下对照组、miR-369-3p mimic NC组、miR-369-3p inhibitor NC组、miR-369-3p inhibitor组caspase3、caspase9蛋白水平显著升高(P<0.05)，miR-369-3p mimic组caspase9蛋白水平升高(P<0.05)。见图3、表3。

图3 Western印迹检测细胞中caspase3、caspase9蛋白表达

表3 各组caspase3、caspase9蛋白表达

2.6miR-369-3p靶向DYRK1A基因 Targetscan(http：//www.targetscan.org/vert_72/)预测结果显示，DYRK1A基因与miR-369-3p存在结合位点，见图4。

图4 DYRK1A基因与miR-369-3p结合位点预测〔4〕

3 讨 论

乳腺癌目前治疗方法以化疗为主，仍有30%～40%患者出现化疗抗性〔6〕。提高患者化疗敏感性对于改善患者生存质量意义重大。其中细胞凋亡在化疗敏感性中发挥重要作用，癌细胞凋亡指数增加，化疗敏感性明显增强，可以通过增强细胞凋亡改善化疗敏感性，从而治疗肿瘤〔7〕。

miRNA在癌细胞凋亡〔8〕和放射抵抗〔9〕中起重要作用。miR-205-3p在结直肠癌细胞中低剂量电离辐射潜在的放射增敏剂，增强化疗敏感性可增强对毒性细胞的杀伤作用，降低对正常细胞的毒性作用，减少正常细胞DNA的损伤，从而达到治疗疾病目的〔10〕；放射抗性神经胶质瘤组织miR-320表达下调，而叉头框转录因子(Fox)M1表达上调，miR-320过表达直接靶向FoxM1下调沉默信息调节因子(sirtuin)1型蛋白表达，促进细胞凋亡，增强神经胶质瘤的放射敏感性〔11〕。miR-369-3p是miR-369的成熟剪辑体之一，是一种功能多样的miRNA，可通过自噬调节参与子宫内膜样腺癌〔12〕；亦是一种与放疗敏感性有关的基因〔13〕。miR-369-3p在顺铂耐药的非小细胞肺癌组织和细胞中表达上调，下调miR-369-3p可提高肺癌细胞对顺铂的耐药性〔14〕；可调控miRNA的表达来影响相关信号通路可调节乳腺癌的化疗敏感性〔15〕。本研究结果提示X线照射可抑制乳腺癌细胞存活，随着X线照射剂量强度的增加，抑制作用加强，X线照射对治疗疾病具有一定疗效，X线照射水平越高，治疗效果越明显。但随着X线照射的增加，对正常细胞杀伤作用加强，同时机体出现放射抵抗〔16〕，发现在较低剂量X线照射对癌细胞有较强杀伤作用是接下来探索重点。升高miR-369-3p水平存活率降低，降低miR-369-3p水平存活率升高；miR-369-3p可在一定程度上影响MDA-MB-231存活率，升高miR-369-3p可抑制细胞增殖提高化疗敏感性，缓解疾病。相同剂量X线照射，升高miR-369-3p水平可提高MDA-MB-231细胞化疗敏感性，从而增强对癌细胞的杀伤作用，同时降低对正常细胞的损害达到治疗疾病目的。

miRNA的3′UTR区结合靶基因调控基因发挥增殖〔17〕、侵袭〔18〕、凋亡〔19〕、化疗敏感性〔20〕等作用。其中DYRK1A作为一种脯氨酸/精氨酸指导下的丝氨酸/苏氨酸磷酸化蛋白激酶，可以介导哺乳动物Fox1的表达，而Fox1可以调控细胞增殖、分化和凋亡，从而增加细胞化疗敏感性〔21〕。另一方面DYRK1A可以直接影响细胞凋亡，例如在神经系统中高表达可促进DNA损伤介导细胞凋亡等引起神经元病变、死亡等病理变化，起致病作用〔22〕；在非小细胞肺癌中表达上调，抑制DYRK1A水平可有效治疗表皮生长因子受体(EGFR)敏感性突变和耐药基因(T790 M)耐药性突变的非小细胞肺癌患者的敏感性从而实现抗癌作用〔23〕。DYRK1A抑制剂可抑制MDA-MB-231增殖从而缓解乳腺癌〔24〕。miR-369-3p与DYRK1A靶向结合，升高miR-369-3p水平降低DYRK1A水平可能缓解乳腺癌〔5〕。本研究提示化疗后可降低DYRK1A蛋白水平，对细胞的杀伤作用加强；低表达DYRK1A蛋白可能促进Fox1的表达，调控DNA的损伤作用加强，促进细胞凋亡从而增加细胞化疗敏感性，从而达到治疗疾病目的。

caspase3、caspase9作为促凋亡蛋白，在MDA-MB-231中促进凋亡蛋白caspase3、caspase9水平可抑制细胞增殖、降低细胞毒性从而实现抗癌作用〔25,26〕。细胞凋亡在化疗敏感性中发挥重要作用，癌细胞凋亡率可以判定肿瘤细胞对化疗的敏感性〔27〕，在宫颈癌耐药细胞中促进caspase3、caspase9水平可提高细胞的化疗敏感性〔28〕。本研究提示相同剂量X线照射，提高miR-369-3p水平可直接作用DYRK1A，抑制DYRK1A蛋白表达从而加强促凋亡蛋白表达、加速癌细胞DNA损伤，从而加速细胞凋亡，提高化疗敏感性。

综上所述，miR-369-3p通过靶向调控DYRK1A可改变乳腺癌MDA-MB-231细胞放疗敏感性，可能是通过凋亡途径实现的。上调miR-369-3p表达可靶向抑制DYRK1A表达，促进细胞凋亡，抑制细胞增殖，提高细胞对X线敏感性。本研究只初步探讨miR-369-3p变化对凋亡蛋白水平的影响，并没有进一步验证DYRK1A与促凋亡蛋白的关系，接下来研究中将探讨二者之间直接关系。