贝伐单抗不同途径给药对角膜移植术后兔角膜血管内皮生长因子表达的影响

尹智坚 李才锐 赵薇 马麦聪 李娟 孙若梅 盖建伟

(大理大学第一附属医院眼科，云南 大理 671000)

角膜病是我国比较常见的致盲眼病，其中大部分患者可通过角膜移植复明，但角膜移植排斥反应仍是患者复明失败的首要原因〔1，2〕。角膜新生血管在角膜移植术后免疫排斥反应过程中起到了重要作用〔3〕。现在共发现了20余个对血管内皮细胞有效力的因子，其中血管内皮生长因子(VEGF)是目前发现的作用最强的出血管生成因子〔4〕。贝伐单抗为重组人源化抗VEGF的单克隆抗体，抗新生血管作用明显，且相对经济，其用于治疗眼部新生血管在国内外已被广泛认可〔5〕。目前关于贝伐单抗治疗板层角膜移植术后新生血管有效的给药方法等问题尚存在许多争议。眼部药物常用给药途径包括滴眼液点眼及局部注射。滴眼液点眼由于滴眼液在眼表蒸发及泪道快速引流，同时由于泪膜、角膜、结膜上皮等屏障的阻挡，造成药物作用时间短、局部浓度低、生物利用率低〔6〕。结膜下注射及层间注射可使药物绕过泪膜及结膜上皮或角膜上皮屏障，在局部提供充足的药物浓度，是比较理想的给药方式。因此，本研究通过建立猪-兔异种板层角膜移植建立板层角膜移植术后新生血管模型，对比贝伐单抗通过滴眼液滴眼、结膜下注射、角膜基质注射3种不同给药方式探讨兔板层角膜移植术术后新生血管的抑制作用，研究贝伐单抗对兔板层角膜移植术后新生血管的影响及适宜的给药方式。

1 材料和方法

1.1材料 受体选用(2.5±0.3)kg健康新西兰兔70只(雌雄兼有)，由大理大学实验动物中心提供，标准动物房饲养，裂隙灯显微镜检查双眼前节正常。供体选用新鲜完整的猪眼球。由大理海春生猪定点屠宰场提供。实验前检查猪眼角膜上皮完整，透明。主要试剂：贝伐珠单抗注射液(100 mg：4 ml/瓶)，瑞士罗氏制药公司。硫酸庆大霉素注射液(2 ml：8万U)，辰欣药业股份有限公司。盐酸丙美卡因滴眼液(15 ml∶75 mg)、妥布霉素滴眼液(5 ml，0.3%)、妥布霉素眼膏(3.5 g，0.3%)，均为比利时爱尔康公司。主要试剂和仪器：磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.3)，上海莼试生物技术有限公司。VEGF抗体(兔多抗)，上海碧云天生物技术有限责任公司。RS-1300超净工作台，苏净集团安泰公司。手持式显微镜及手术显微镜，苏州六六科技有限公司。电子分析天平(JA5003 型)，北京精科天平厂。全自动高压蒸汽消毒器，日本SANYO公司。4℃，-20℃，冰箱青岛海尔集团。Leica轮转式切片机，Leica仪器有限公司。烤片机(KYP-1型)，天津航空机电公司。本研究符合动物伦理学标准且获得医院伦理委员会批准。

1.2兔角膜移植术后新生血管模型建立 取新鲜猪眼去除猪眼球表面筋膜和肌肉组织，暴露眼球，使用生理盐水充分冲洗后浸泡于 1∶1 000 的庆大霉素盐水中 20 min，延角膜缘后3 mm剪下带有巩膜的角膜片，在手术显微镜下用8.5 mm环钻在角膜中央钻切，手术刀剖切厚度约为2/3兔角膜厚度的猪眼角膜制成植片。25%乌拉坦溶液4 ml/kg耳缘静脉注射麻醉，术眼滴丙美卡因滴眼液数滴行表面麻醉，将兔右眼固定于手术显微镜下，按眼科手术常规消毒铺巾，开睑器开睑，8.25 mm环钻于兔角膜中央钻切，手术刀剖切2/3～4/5角膜厚度的角膜组织，形成植床。将植片覆盖于植床上，10-0缝线间断缝合12针，包埋缝线。术毕，结膜囊内涂妥布霉素眼膏，术后滴用妥布霉素4次/d。本研究中角膜移植术后14 d，66只兔角膜层间新生血管形成，4只兔死亡，说明兔角膜移植术后新生血管模型建立成功。

1.3动物分组及药物处理 将造模成功的角膜移植术后新生血管兔(n=66)随机分为实验组(n=30，贝伐单抗0.1 ml)和对照组(n=30，生理盐水0.1 ml)及空白对照组(n=6，未做任何处理)，实验组及对照组根据给药途径不同随机各分为3个亚组，即滴眼液滴眼组、结膜下注射组、角膜层间注射组各10只。

1.4角膜血管内皮生长因子表达量的测定

1.4.1角膜采集 给药后1、7、14、21 d，空白对照组随机取1只，实验组及对照组每个亚组分别随机选取2只兔处死，生理盐水冲洗双眼，清洁无菌纱布吸干，延角膜缘后3 mm剪下带有巩膜的角膜片，取材后样本固定于4%多聚酶甲醛(PFA)溶液，待测。

1.4.2样本处理 取材后固定于4%PFA溶液48 h，用各浓度的乙醇溶液反复脱水各30 min，放入配制好的二甲苯Ⅰ及二甲苯Ⅱ溶液中各浸泡15 min，以角膜标本透明后处理成功。浸蜡：将待检测标本置于配制好的石蜡Ⅰ及石蜡Ⅱ溶液中各60 min。包埋：将石蜡模子稍加热后放入蜡模，再倒入少许熔蜡进行包埋处理。切片：将石蜡块冷冻30 min后，用切片机4 μm厚度进行切片。脱蜡：将切片放入配制好的二甲苯Ⅰ及二甲苯Ⅱ溶液中各浸泡15 min进行脱蜡处理。水化：将切片浸于各梯度的酒精脱水各5 min，然后用PBS反复冲洗3次。抗原修复：将切片置于枸橼酸缓冲液中，微波炉加热5 min后自然冷却，再用PBS冲洗3次。灭活：切片上滴加3%过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶，常温下放置15 min后用PBS冲洗3次，擦拭切片上残留液体。染色：切片加入一抗(兔VEGF抗体)，于37℃温箱中孵育2 h，结束后用PBS冲洗3次，擦去切片上残余液体后加入二抗，37℃温箱中孵育1 h。观察：切片滴加二氨基联苯胺(DAB)显色液，显微镜下观察并照相，阳性信号为毛细血管内皮细胞中可见棕黄色或棕褐色颗粒。

1.5统计学处理 采用SPSS22.0软件进行重复测量方差分析、LSD-t检验、单因素方差分析、独立样本t检验。

2 结 果

2.1不同途径给药对兔角膜VEGF表达的影响 3种途径给药后14 d，实验组兔角膜中VEGF表达的抑制作用最明显，对照组3种途径给药后角膜中VEGF表达持续增加，给药后7 d、14 d、21 d，实验及对照组角膜VEGF表达差异均有统计学意义(P<0.05)。实验组3种途径给药后1 d、7 d、14 d、21 d角膜VEGF表达同时间点比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。不同途径给药实验组滴眼液滴眼、结膜下注射及角膜层间注射7 d、14 d、21 d角膜VEGF表达均低于空白对照组(0.511±0.020、0.520±0.016、0.550±0.018)，差异均有统计学意义(P<0.05)，而1 d角膜VEGF表达与空白对照组(0.489±0.018)无显著性差异(P>0.05)。

表1 不同途径给药对鼠角膜VEGF表达的影响

2.2免疫组化检测各组角膜中VEGF蛋白表达 不同途径给药后，角膜切片中可见棕黄色或棕褐色颗粒，为VEGF染色后阳性信号。可见空白对照组及对照组7 d、14 d、21 d棕黄色颗粒逐渐增加，实验组棕黄色颗粒逐渐减少，见图1。

图1 各组角膜组织中VEGF蛋白表达差异(免疫组化，×100)

3 讨 论

角膜移植手术后的免疫排斥反应是造成移植失败的最常见、最主要的原因。随着对免疫排斥发生机制认识的深入，发现角膜新生血管是众多危险因素中的一个非常重要的危险因素〔7〕。正常角膜中低水平的促血管生成因子和高水平的抗血管生成因子的平衡状态维持了角膜的透明性及无血管性，当异体角膜移植后，该平衡被打破，促血管生成因子将会促进新生血管的发生。其中，VEGF是目前发现的最重要的促血管生成因子〔8〕。大量研究显示，通过拮抗VEGF可显著减少新生血管的生成〔9～11〕。贝伐单抗作为一种重组人源化VEGF单克隆抗体，其抗体免疫球蛋白抗原(IgG)1可与VEGF受体(VEGFR)结合，抑制VEGF的生物活性，从而起到减少、消退新生血管的作用。与其他抗VEGF药物相比，贝伐单抗因为是由仓鼠卵巢细胞经过分子生物学技术加工而来，含有一部分鼠源性蛋白，分子量较大，约为149 kD，抗原性相对较低，作用时间长，价格较便宜。其作用效果与同类药物等相当，具有一定的性价比〔12〕。本研究采用猪-兔异种异体板层角膜移植的方式建模，避免了传统穿透性角膜移植方式建模术后实验动物局部感染，眼内容物流出，并发眼部其他疾病的风险，术后免疫排斥反应的时间及程度较其他方式未见明显差别，是一种安全、有效的建模方式。本研究结果说明，不同方式给药后对VEGF的拮抗作用效果相当，较对照组VEGF的表达明显下降，分析原因认为可能各组VEGF拮抗已达到饱和，故而给药后VEGF不同时间及不同给药方式之间区别不明显。而结膜下注射操作简单，可在短时间内达到较高的药物浓度，是一种简便易行的给药方式，避免了长期滴眼液对眼表细胞的损伤及角膜层间注射对角膜基质的损伤，作用持久，效果显著。近年来，越来越多的血管生长相关因子被发现和证实〔13,14〕。迄今为止，已报道有21种血管抑制因子及17种血管生成因子〔15〕。其中许多已经被明确与血管增生相关〔16～18〕。因此，本研究中贝伐单抗不能完全消退新生血管，角膜新生血管的生成及消退机制仍需进一步研究，以期发现更为高效的抗角膜新生血管药物。同时本研究也有一定的不足，存在实验样本量小、跟踪时间短等不足，需要今后更深入的研究及讨论。