LncRNA FAS-AS1对胶质瘤细胞Fas介导凋亡的影响

刘晨 张祥 姚俊朝 荣金奎 刘红军 金治宾 王垒垒

(1沧州市中心医院神经外五科，河北 沧州 061000；2沧州市献县人民医院神经外科；3盐山阜德医院急诊科)

胶质瘤是原发性颅内中枢神经系统恶性肿瘤之一，占颅内原发恶性肿瘤的50%～60%，具有高侵袭性及高致死性〔1,2〕。目前胶质瘤的治疗手段有手术、放疗、化疗，但由于其浸润性生长方式及对放化疗的耐受性，即便通过手术切除联合放化疗，其整体治疗效果依旧欠佳，患者的中位生存期仅有10～14个月，5年生存率仅有5%〔3,4〕。因此，寻找新的可靠的治疗靶点成为胶质瘤研究的重点之一。长链非编码RNA(LncRNA)是一类非编码RNA分子，长度超过200个核苷酸，通过参与基因的表达调控，在肿瘤进展中发挥致癌或抑癌作用〔5〕。研究表明，LncRNAs在胶质瘤进展过程中起重要作用，LncRNAs MALAT1高表达与胶质瘤恶性程度、患者预后不良密切相关，LncRNA PLAC2可通过靶向神经胶质瘤中核糖体蛋白L36诱导细胞周期停滞〔6,7〕。LncRNA FAS-AS1可通过介导宿主基因Fas表达影响乳腺癌增殖能力〔8〕。然而，LncRNA FAS-AS1对胶质瘤的影响尚不清楚。本研究旨在探讨LncRNA FAS-AS1对胶质瘤细胞Fas介导凋亡的影响及其可能机制。

1 材料与方法

1.1细胞、试剂与仪器 人脑胶质瘤细胞U251(货号：YS-1302X)购自美国sciencell公司；胎牛血清(货号：FBS500-S)购自澳大利亚AusGeneX公司；DMEM培养基(货号：KL-P0032)购自德国merck/sigma公司；Lipofectamine 2000转染试剂(货号：11668030)购自美国Life Technologies公司；siRNA-NC、siRNA-FAS-AS1及FAS-AS1、Fas、GAPDH引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成；pcDNA3.1(货号：PVT1004)购自武汉维克赛思科技有限公司；实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒(货号：K1002S)购自美国Promega公司；CCK-8试剂(货号：CK-04)购自日本同仁化学研究所；膜联蛋白(Annexin)V-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)细胞凋亡检测试剂盒(货号：S0185)购自哈尔滨新海基因检测有限公司；Fas抗体、Fas配体(FasL)抗体、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)抗体、Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体、GAPDH抗体(货号：ab82419、ab15285、ab196495、ab104156、ab181602)购自Abcam公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔(货号：0295G-HRP)购自美国Santa公司；恒温培养箱(型号：MIR-162-PC/MIR-262-PC)购自日本松下公司；荧光定量PCR仪(型号：ABI 7500)购自美国Applied Biosystems公司；酶标仪(型号：Stat Fax-2100)购自美国Awareness公司；流式细胞仪(型号：BD FACSCanto II)购自美国BD公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养与分组 U251细胞用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的DMEM培养基，置于37℃、5% CO2、90%相对湿度培养箱中培养，细胞融合率达80%以上时，用胰酶消化、传代。取对数生长期U251细胞分为对照组、si-NC组、si-FAS-AS1组、pcDNA3.1-NC组和pcDNA3.1-FAS-AS1组，对照组不进行转染，si-NC组、si-FAS-AS1组、pcDNA3.1-NC组和pcDNA3.1-FAS-AS1组细胞使用Lipofectamine 2000转染试剂分别转染siRNA-NC、siRNA-FAS-AS1、pcDNA3.1和pcDNA3.1-FAS-AS1。

1.2.2qRT-PCR法检测各组U251细胞中FAS-AS1、Fas mRNA表达情况 将U251细胞转染后培养48 h，收集细胞，使用TRIzol试剂提取总RNA，逆转录合成cDNA，按照qRT-PCR试剂盒说明书，在荧光定量PCR仪上检测FAS-AS1、Fas mRNA表达水平，以2-ΔΔCt法表示，内参基因为GAPDH。反应程序：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，循环40次。FAS-AS1上游引物：5′-ACCGTGAAGGCATAAAAGCAA-3′，下游：5′-TTTTGCGCTCACGACATGC-3′；Fas上游引物：5′-CCCGGACCCAGAATACCAAG-3′，下游：5′-AAGACAAAGCCACCCCAAGT-3′；内参GAPDH上游引物：5′-GGAGTCAACGGATTTGGTCGTATTG-3′，下游：5′-TCTCGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′。

1.2.3CCK-8法检测各组U251细胞增殖情况 将U251细胞转染后培养48 h，加入CCK-8试剂后继续培养2 h，使用全自动酶标仪于波长450 nm处检测各孔吸光度(OD)值。

1.2.4流式细胞仪检测各组U251细胞凋亡情况 将U251细胞转染后培养48 h，收集细胞，胰蛋白酶消化，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，使用400 μl 1×结合缓冲液调整成细胞浓度为1×106个/ml的细胞悬浮液，按照Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒操作说明书步骤，分别加入Annexin V-FITC、PI各5 μl，避光孵育1 h，使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.5Western印迹法检测各组U251细胞中Fas、FasL、Bcl-2、Bax蛋白表达情况 将U251细胞转染后培养48 h，收集细胞，提取细胞总蛋白，BCA蛋白试剂盒测定蛋白浓度，取等量蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，将蛋白转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭1 h，加入Fas抗体(1∶500)、FasL抗体(1∶500)、Bcl-2抗体(1∶500)、Bax抗体(1∶500)、GAPDH抗体(1∶500)，4℃孵育过夜，TBST洗涤，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1∶1 000)，室温孵育2 h，化学发光法显色，拍摄图像，分析条带灰度，计算目的蛋白相对表达量。目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度/内参GAPDH条带灰度。

1.3统计学分析 采用SPSS24.0统计学软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1各组U251细胞中FAS-AS1、Fas mRNA表达情况 对照组、si-NC组、pcDNA3.1-NC组U251细胞中FAS-AS1、Fas mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。与si-NC组相比，si-FAS-AS1组U251细胞中FAS-AS1、Fas mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。与pcDNA3.1-NC组相比，pcDNA3.1-FAS-AS1组U251细胞中FAS-AS1、Fas mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。见表1。

2.2各组U251细胞增殖情况 对照组、si-NC组、pcDNA3.1-NC组U251细胞OD值差异无统计学意义(P>0.05)。与si-NC组相比，si-FAS-AS1组U251细胞OD值显著升高(P<0.05)。与pcDNA3.1-NC组相比，pcDNA3.1-FAS-AS1组U251细胞OD值显著降低(P<0.05)。见表1。

2.3各组U251细胞凋亡情况 对照组、si-NC组、pcDNA3.1-NC组U251细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。与si-NC组相比，si-FAS-AS1组U251细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。与pcDNA3.1-NC组相比，pcDNA3.1-FAS-AS1组U251细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。见表1、图1。

表1 各组U251细胞OD值、凋亡率、FAS-AS1、Fas mRNA及Fas、FasL、Bcl-2、Bax蛋白表达水平比较

图1 流式细胞仪检测各组U251细胞凋亡情况

2.4各组U251细胞中Fas、FasL、Bcl-2、Bax蛋白表达情况 对照组、si-NC组、pcDNA3.1-NC组U251细胞中Fas、FasL、Bcl-2、Bax蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。与si-NC组相比，si-FAS-AS1组U251细胞中Fas、FasL、Bax蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。与pcDNA3.1-NC组相比，pcDNA3.1-FAS-AS1组U251细胞中Fas、FasL、Bax蛋白表达水平显著升高，Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。见表1、图2。

1～5：对照组、si-NC组、si-FAS-AS1组、pcDNA3.1-NC组、pcDNA3.1-FAS-AS1组

3 讨 论

胶质瘤是最常见的来源于神经上皮组织的原发性中枢神经系统恶性肿瘤，发病率、复发率、死亡率高，治愈率低。手术切除联合放化疗是胶质瘤治疗的主要方法，但存在一定局限性，高级别的胶质瘤患者易在术后复发，平均生存期低于15个月〔9〕。LncRNA可通过影响RNA的转录、剪切、降解等生物学过程，调节多种生物学机制，进而影响细胞的生物学活动〔10〕。研究发现，LncRNA的异常表达在各种癌症的发生发展中起重要作用，且一些LncRNA可作为胶质瘤的潜在肿瘤标志物或治疗靶点〔11,12〕。

FAS-AS1是Fas的反义LncRNA，以反义的方式从人类染色体上的Fas基因中转录出来，通过影响RNA剪接调控Fas，与细胞凋亡过程密切相关〔13〕。研究表明，FAS-AS1可通过Fas介导的细胞死亡信号途径在红细胞生成过程中起重要作用〔14〕。Zhu等〔15〕研究发现，降低FAS-AS1的表达可抑制软骨细胞凋亡并促进软骨细胞增殖。Yang等〔16〕研究表明，FAS-AS1在非小细胞肺癌中显著下调，能抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭过程。本研究结果显示，成功下调U251细胞中FAS-AS1表达水平后，U251细胞OD值显著升高，细胞凋亡率显著降低；反之，U251细胞OD值显著降低，细胞凋亡率显著升高，提示FAS-AS1可促进U251细胞凋亡并抑制其增殖，但其相关机制尚不清楚。

Fas是启动细胞凋亡信号的经典受体之一，与其配体FasL结合后可形成死亡诱导复合物活化含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-8及Caspase家族其他成员，在肿瘤细胞增殖、降解、凋亡过程中发挥重要作用〔17〕。王晓丽等〔18〕研究发现，Fas/FasL通路活化可导致下游Caspase途径的活化，介导17-羟-岩大戟内酯B诱导的脑胶质瘤细胞凋亡过程。本研究结果显示，FAS-AS1作为Fas的反义转录本，成功下调U251细胞中FAS-AS1表达水平后，U251细胞中Fas mRNA及蛋白表达水平显著降低，FasL蛋白表达水平亦显著降低；反之，U251细胞中Fas mRNA及蛋白表达水平显著升高，FasL蛋白表达水平亦显著升高，提示FAS-AS1可影响Fas/FasL通路活化。Bcl-2家族蛋白在调控细胞凋亡过程中发挥关键作用，其中，抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax是该家族重要成员〔19〕。本研究结果显示，成功下调U251细胞中FAS-AS1表达水平后，U251细胞中Bax蛋白表达水平显著降低，Bcl-2蛋白表达水平显著升高；反之，U251细胞中Bax蛋白表达水平显著升高，Bcl-2蛋白表达水平显著降低，提示FAS-AS1通过影响Bax、Bcl-2蛋白水平，调控U251细胞增殖、凋亡过程，推测FAS-AS1通过激活Fas/FasL通路，可能经由Caspase家族途径，影响凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2水平，进而发挥对U251细胞的凋亡促进、增殖抑制作用〔20〕。

综上所述，LncRNA FAS-AS1可以激活Fas/FasL通路，上调Bax蛋白表达，下调Bcl-2蛋白表达，促进胶质瘤U251细胞凋亡并抑制其增殖，可作为胶质瘤的潜在治疗靶点。