基于网络药理学及分子对接探讨消渴肾安汤治疗糖尿病肾病的作用机制

陈锦英 李汶航 齐昊天 聂维辰 米佳 南征

(1长春中医药大学，吉林 长春 130117;2成都中医药大学附属眉山医院；3北京中医药大学；4 长春中医药大学附属医院)

糖尿病肾病(DKD)的主要临床表现为血糖增高伴进行性肾衰竭〔1〕，可导致终末期肾病(ESRD)。现代治疗DKD常采用纠正高血糖、高血压和血脂异常对症治疗及改变生活方式等方法延缓肾脏衰竭的进程。中医认为，DKD属于“消渴肾病”范畴，病理的关键在于肺、脾、肾功能失调〔2〕。中医药目前已广泛应用于肾病及其并发症的治疗，可改善肾功能、有效延缓肾衰竭进程，以“邪伏膜原，毒损肾络”为病机关键，创立消渴肾安汤〔3〕,通过导邪解毒益肾通络之法治疗DKD，在临床治疗中疗效确切。但目前对相应中药配方组合的研究尚缺少对应的评判标准，需要一项相对统一的研究方法对中药复方进行研判，因此采用网络药理学将疾病和药物整合到生物分子网络中，预测活性成分和作用机制。本研究采用网络药理学方法及分子对接技术探索消渴肾安汤治疗DKD的潜在作用机制。

1 材料和方法

1.1消渴肾安汤生物活性成分和靶点筛选 药物成分及靶点筛选：在TCMSP数据库中检索消渴肾安汤组成药物大黄、土茯苓、黄芪、黄精、覆盆子、金荞麦、木蝴蝶、丹参、槟榔、草果、厚朴的活性成分，设定口服生物利用度(OB)≥30%、类药指数(DL)≥0.18，对活性成分进行筛选，若无法获得相关靶点信息则将有效成分进行靶点预测。预测相关性成分潜在靶点：从Pubchem数据库获取相关有效成分的结构化数据格式(SDF)结构，随后将所得的结构通过Swiss Target Prediction数据库进行靶点预测，取其中评分0.1的靶标作为潜在靶点。将所得的药物成分和相关靶点以Cytoscape8.9.2构建“药物-靶点”网络，选取其中Network Analyzer模块对本方的结构网络进行分析。

1.2DKD靶点筛选 以“DKD”为关键词，检索OMIM、Disgenet、Genecards等数据库，将取得的靶点进行合并、去重，得到疾病作用靶点。

1.3消渴肾安汤活性成分与DKD共同靶点的筛选 利用微生信(网址：http：//www.bioinformatics.com.cn/)将二者靶点取交集并绘制韦恩图。

1.4蛋白相互作用(PPI)网络 利用Metascape平台(https://metascape.org/)对共同靶点进行分析，获得Metascape Gene List Analysis Report。将获得的PPI导入Cystoscap8.9.2中工具进行优化处理。以“homo sapiens”模块对导入的相关靶点进行分析，通过Network Analyzer工具进行拓扑分析，以度值、介值、平均最短路径和紧密度这四个参数进行参考，将其中分值排序前10的基因作为核心靶点。

1.5基因本体(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析 以R软件的Bioconductor包对相关基因作GO与KEGG富集分析，选取其中P<0.05的通路进行注释，以条形图和气泡图形式输出所获得的通路和生物学功能。

1.6分子对接 使用Schrödinger Maestro软件对相关成分和靶点进行分子对接，以Protein Preparation Wizard模块预处理相关受体并进行优化，利用OPLS3e力场进行约束最小化， LigPrep模块的默认设置制备相关化合物的结构。以Glide模块导入制备好的受体，预测相应的对接位点。以标准对接(SP)方法对分子进行对接并完成筛选。根据其中化合物与蛋白间的作用情况预测化合物与蛋白残基作用的特点，参考化合物的对接分值，推测拟筛的化合物活性特点。

2 结 果

2.1消渴肾安汤潜在生物活性化合物和靶点 共得到主要活性成分149个，主要活性成分分析见图1。

图1 消渴肾安汤有效成分

2.2DKD靶点筛选 以“DKD”为关键词分别在OMIM、Disgenet、Genecards 数据库进行检索，将获得到的疾病靶点合并去重后，按照Score≥中位数值的目标靶点为界值，筛选到1 372个疾病靶点。

2.3药物活性成分-疾病共同靶点筛选 将筛选的消渴肾安汤活性成分靶点与DKD靶点取交集，并通过微生信软件绘制韦恩图(VEEN)，得到消渴肾安汤与DKD共同靶点76个。颜色随着Degree值增加而加深，表明该成分越重要，其中活性最强的成分为C13：Baicalin(黄芩苷)，见图2。

红色：活性成分靶点，绿色：消渴肾安汤活性成分

2.4PPI构建 将76个共同靶点导入Metascape平台，并通过分数进行排序得到相关靶点基因NR3C1、RELA、FOS、PCNA、ESR1、MDM2、CCND1、IL6、MTOR、IKBKB。

2.5MCODE模块注释 将已经构建好的PPI导入Cystoscap8.9.2中，使用MCODE模块进行基因簇的分析及核心靶点的筛选。总共得到5个基因簇和5个核心基因(PRKCA、EGFR、ESR1、CYP2C9、ERBB2)。见图3。

图3 PPI与MCODE模块注释

2.6GO富集分析和KEGG通路分析

2.6.1GO分析 分别通过GO分析选取生物学过程、细胞组分及分子功能3部分对41个共通基因进行注释分析。结果显示，交集基因集合共涉及3 299条生物学过程，主要为对类固醇激素的反应、对药物的反应、对酮的反应、细胞对化学应激的反应和对氧化应激的反应等方面；交集基因集合共涉及237条细胞组分表达过程；主要为血浆脂蛋白颗粒、脂蛋白颗粒、蛋白脂复合物、基质膜和膜筏等组分；交集基因集主要参与377个与分子功能相关的过程，主要有核受体活性、配体激活的转录因子活性、类固醇结合、DNA结合的转录因子结合和转录辅因子结合等相关功能。见图4。

AGE-RAGE:晚期糖基化终末产物-糖基化终末产物受体

2.6.2KEGG分析 76个共同靶点共富集得到106条KEGG通路，前10的关键通路见图5，富集到通路的靶点根据degree值排序，得到RAF1、BCL-2两个最重要的靶点。

图5 KEGG 通路富集

2.7分子对接验证 RAF1、BCL-2与黄芩苷结合能分别为-8.148、-7.265 kCal/mol。另外蛋白与小分子的复合物采用Pymol2.1进行可视化分析，见图6。黄芩苷化合物与靶点蛋白存在很好地结合作用且匹配度高，结合能均小于-5 kCal/mol。将对接后化合物与蛋白形成的复合物利用Pymol2.1软件进行可视化，得到化合物与蛋白的结合模式，根据结合模式可以很清晰看到化合物与蛋白口袋相结合的氨基酸残基。

图6 黄芩苷与RAF1、BCL-2分子对接验证

3 讨 论

失调的内分泌代谢环境是导致DKD的重要原因之一，临床研究表明高血糖在 DKD 起始中起关键作用，但其在控制进展的具体意义仍不明确。有可追溯的研究发现许多2型糖尿病(T2DM)患者在被诊断患有糖尿病之前可能已经经历了多年的代谢改变〔4,5〕，所以导致他们被诊断为 T2DM 之前就已患上DKD〔6〕。据统计，美国约有200 000例DKD患者接受ESRD护理，且接受透析的人数以每年约5 000的数目递增。即便如此，接受RSRD护理的DKD患者仍面临约20%的年死亡率，这远超许多实体癌(包括前列腺癌、乳腺癌甚至肾细胞癌)的死亡率〔7〕。对于DKD患者，缺乏特异性西医治疗，最直接有效的治疗方法是控糖、抑制肾病进展。中药方剂具有多成分、多靶点、多途径的特点，由于其复杂的特性，导致仅靠普通的研究方法很难解释其药理机制。本研究推测黄芩苷可能是消渴肾安汤中发挥关键作用的潜在活性成分。事实上，黄芩苷具有抗炎〔8〕、抑癌症〔9〕、保肝作用〔10〕，具有很强的抗氧化作用〔11〕。

Raf 包括A-Raf、B-Raf、C-Raf(即RAF1)，是GTP结合蛋白Ras所募集的主要效应因子，能激活有丝分裂原活化蛋白激酶(MEK-MAP)激酶通路〔12〕。A-Raf、B-Raf、c-Raf 的序列和功能相似，但是调节方式各不相同〔13〕，c-Raf的活化涉及多个激活位点(包括 Ser338、Tyr341、Thr491、Ser494、Ser497 和 Ser499)的磷酸化。c-Raf 上的抑制性 14-3-3 结合位点 Ser259 和 Ser621 可以分别由 Akt 和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)来磷酸化〔14,15〕，而c-Raf 蛋白的失活特性与Ser29、Ser43、Ser289、Ser296、 Ser301 和 Ser642 位点的过度磷酸化相关，并依赖于下游的 MEK 信号转导，从而导致 c-Raf 对后续的激活事件无反应〔16〕。在各种凋亡刺激因子作用下，BCL-2可通过抑制线粒体细胞色素c的释放而发挥存活功能〔17〕，它与线粒体钙稳态和质子流的调节有关〔18〕。现已发现BCL-2的Thr56、Ser70、Thr74 和 Ser87等磷酸化位点〔19〕。经证实，这些磷酸化位点可能是凋亡信号调节激酶(ASK)1/丝裂原活化蛋白激酶(MKK)7/应激活化蛋白激酶(JNK)1通路的靶标〔20〕，并且BCL-2 的磷酸化可能是有丝分裂活动的一个标志〔21〕。白细胞介素3和JNK诱导的 BCL-2 在 Ser70 位点磷酸化，可能对增强抗凋亡作用至关重要〔22〕。DKD患者体内的高糖环境，使肾脏细胞的氧化代谢活动受到影响，在缺氧和炎症刺激的双重作用下，肾脏细胞出现凋亡、坏死，因此DKD患者的治疗目标是保护肾脏，改善体内高糖环境。研究表明，脂肪酸氧化向糖酵解的转化可以产生类似于促进肿瘤细胞增殖和凋亡逃逸的作用，提高细胞在缺氧条件下的存活率〔23,24〕。本文证实了消渴肾安汤的潜在作用机制是基于多个靶点和多个信号通路的协同作用。富集途径主要涉及类固醇激素反应、对酮反应、细胞化学应激、氧化应激、皮质类固醇反应、辐射反应调节等方面。线粒体功能障碍与氧化应激和酮代谢密切相关〔25～27〕。研究表明，DKD患者存在明显的氧化应激反应导致的线粒体功能障碍〔28〕，有类似研究发现，木蝴蝶茎皮的主要提取物(黄芩苷和白杨素)可通过升高蛋白激酶(PK)C，降低核转录因子(NF)-κB及AGEs/RAGE，改善细胞氧化应激及炎症反应〔29〕。由此可以推测，消渴肾安汤治疗DKD的主要机制可能是下调炎症因子的表达，对抗氧化应激，从而抑制肾脏内细胞氧化应激状态、抑制细胞凋亡。更重要的是，保护线粒体可能是消渴肾安汤治疗DKD的潜在机制。

综上，黄芩苷可能通过作用于RAF1、BCL-2这两个靶标影响后续生物学通路的激活，从而调节DKD的进展。