耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌对替加环素的耐药机制研究进展

荣 芳, 吴 峰, 周 俊

(1. 扬州大学附属医院 呼吸与危重症医学科, 江苏 扬州, 225000;2. 大连医科大学研究生院, 辽宁 大连, 116044)

肺炎克雷伯菌(KP)为肠杆菌属，根据毒力特点的不同，可分为普通型肺炎克雷伯菌(cKp)和高毒力肺炎克雷伯菌(hvKp)[1-2]。cKp属于一种常见的医院内感染病原体，是引起严重呼吸道感染的重要病原菌之一，容易引发消化道、皮肤、泌尿道、血液等部位感染[3], 在长期使用抗菌药物、侵入性治疗、留置导管等原因导致机体免疫力低下的人群中，机会性感染概率更高[4-5]。而hvKp在社区相关感染中更常见，坏死性肺炎、化脓性肝脓肿、内源性眼内炎、脑膜炎、脾脓肿等社区常见疾病的发生与hvKp感染有关[6]。

近年来，抗菌药物的泛用和滥用，使得KP对β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类等临床上使用频率较高的抗生素均产生了不同程度的耐药，多重耐药菌成为临床亟需攻克的难题[7]。碳青霉烯类抗生素是临床治疗多重耐药菌的重要武器，但随着抗菌药物的不合理使用, KP对多种抗生素均出现了耐药[8]。随着碳青霉烯类抗菌药物在临床上的推广使用，耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(CRKP)的分离率逐年上升，其感染控制难度大，病死率高[9]。替加环素(TGC)作为一种极少数对多重耐药菌有良好效能的药物，上市后不久就发现了耐药菌株，给临床治疗和院感防控带来了挑战，本文就TGC耐药CRKP菌株(T-CRKP)的耐药机制研究情况展开综述，以期为预防与控制该菌的传播和流行提供依据。

1 CRKP的流行现状

临床上投入使用碳青霉烯类药物以来，耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(CRE)在世界范围内的暴发和流行越来越多被报道。流行病学调查显示，CRKP是国内外最常见的CRE, 而且由CRKP造成的患者血流感染病死率非常高。美国疾控中心(CDC)数据[10]显示, 2001—2011年美国CRE比率从1.2%增至4.2%, CRKP分离率从1.6%增至10.4%, 2016年欧洲CDC报告显示，欧洲国家的CRKP分离率浮动为0～66.9%。2005—2018年中国KP对碳青霉烯类的耐药率呈持续上升趋势，其中KP对亚胺培南和美罗培南的耐药率从3.0%和2.9%分别上升到25.0%和26.3%; 2019年和2020年KP对碳青霉烯类的耐药率虽然呈连续下降趋势，但其检出率仍超过23.0%[11], 以上数据表明中国耐药菌株的控制情况不容乐观。目前中国临床CRKP流行克隆处于动态进化之中，但是在稳定遗传情况下出现向高毒力和高耐药方向进化的端倪，并已在全国许多地区播散，需引起高度重视。

2 CRKP对替加环素的耐药现状

TGC是一种半合成苷氨酰环素，为米诺环素的衍生物之一，是在米诺环素D环 C-9位置上加了侧链，稳定性更强，不仅克服了制约四环素类抗菌疗效的常见耐药机制，还能应对多重耐药菌的感染[12]，2005年被美国食品和药物管理局(FDA)批准使用[13], 2019年经中国国家药品监督管理局批准上市后投入临床使用。体外研究[14]表明TGC对产KPC酶和金属酶的肠杆菌科的抗菌效能达到100%。TGC不仅对肠杆菌科细菌具有广谱高效的抗菌效能，而且对大多数革兰阴性菌尤其是耐药菌均具有显著的抗菌活性，被认为是应对革兰阴性菌多重耐药的最后一道屏障[15-16]。

目前临床上多以TGC、多黏菌素作为CRKP感染治疗的保底用药, 2015年由FDA批准上市的头孢他啶/阿维巴坦也可以用来治疗CRKP患者[17]。但是由于多粘菌素、头孢他啶/阿维巴坦临床治疗费用较高, TGC仍是目前临床治疗CRKP感染的第一选择，其应用给CRKP感染的治疗带来了显著效果。但作为治疗CRKP的最后手段, TGC的用量亦在逐步攀升，与此同时带来的耐药问题也日益凸显，其上市投入临床后不久就出现了耐药菌株[18]。虽然全球各地的耐药案例统计结果不尽相同，但总体上耐药率呈逐年上升趋势，使得KP感染几乎陷入无药可治的困境。

3 CRKP对TGC的耐药机制

自TGC上市应用以来，临床上发现的T-CRKP菌株逐渐增多。T-CRKP耐药机制复杂多样，近年来关于T-CRKP菌株已有相关研究，但其具体耐药机制目前尚未明确。回顾国内外相关研究，可大致分为以下几类。

3.1 RND型外排泵过表达

外排泵是位于细菌内膜的一种主动转运体，细菌可以借助这个转运体将进入胞内的抗菌药物主动泵出细胞，通过降低抗菌药物浓度达到耐药的效果，其在KP中普遍存在且分布广泛。肠杆菌科中报道较多的耐药机制是AcrAB-Tolc和 OqxAB的过表达以及新发现的KpgABC外排泵的过表达。

AcrAB-Tolc外排泵在RND型外排泵中最常见，由外排转运蛋白AcrAB、通道蛋白Tolc、膜融合蛋白AcrA 3个部分组成，本质上是一个质子依赖型的多药耐药泵，以消耗质子动力的方式将抗菌药物从菌体排出。关于AcrAB-Tolc外排泵的研究也比较透彻，在大肠杆菌、沙门氏菌的研究中已对其机制进行了明确阐述，其作为一种抗菌药物外排泵，对进入细菌胞内的氯霉素类、四环素类以及在浆液中发挥抗菌活性的β-内酰胺类抗生素均具有良好的识别与外排作用。先前研究[19]表明, AcrAB-Tolc外排泵中ramA、mraA、soxA、rob等调控基因表达的产物属于AraC/XylS调控蛋白家族，可起到上调acrAB-tolC基因表达的作用，而acrR基因编码的蛋白可下调acrAB-tolC的表达[20]。在AcrAB-Tolc外排泵的间接调控作用中,ramR、marR、soxR调控基因分别与ramA、marA、soxS的转录抑制因子一一对应，通过抑制acrAB-tolC上调基因的表达进而阻止外排泵AcrAB的合成来发挥负性调控作用[21]。若ramR发生基因突变、RamR表达量减少或下降，其对ramA基因产生的抑制效能就会降低, RamA的表达量会增加, AcrAB-TolC也会因此过表达。外排泵的过表达使得TGC难以进入细菌体内发挥作用，从而产生了耐药性。

同属于RND 家族的OqxAB外排泵，是一种由质粒编码的蛋白产物，最早研究发现与喹诺酮类耐药相关，现经研究证实与肠杆菌科细菌发生多重耐药(MDR)也有一定关系。OqxAB同样有其表达调控基因rarj与oqxR等, OqxAB的过表达可使进入菌体内多种药物的敏感性降低，如替加环素、喹诺酮类、呋喃妥因和氯霉素等[22], 从而产生耐药效果。

KpgABC外排泵是RND家族新成员，于2014 年被NIELSEN L E等[23]首次发现，之后JUAN C H等[24]在KP菌血症患者中发现kpgABC基因的过表达会提升替加环素的耐药率，且通过克隆转化等实验证明不需要其他外排泵的辅助也可独立发挥排菌作用，虽然没有达到EUCAST判断标准，但KP对替加环素的MIC明显增加。这一发现对T-CRKP的耐药性研究有了新的进展，但是目前关于KpgABC外排泵的其他研究还十分有限。

3.2 四环素耐药相关基因突变

TGC是新一代四环素类抗菌药物，最早研究发现可有效地克服四环素类传统耐药机制，而AKIYAMA T等[25]研究发现沙门菌携带的tetA基因不仅对四环素耐药，也会使替加环素对细菌的敏感性降低。后来有研究发现在大肠埃希菌中的Tet蛋白均可以通过突变对替加环素产生抗性。其中，TetA和TetX对替加环素产生高水平抗性，而TetK和TetM对其产生低水平抗性。研究[26]表明TetX能够表达一种依赖于黄素的单加氧酶，这种酶可对替加环素进行羟基化修饰，使得替加环素在弱酸环境中失去稳定性而丧失抗菌活性，但是有关该基因的作用机制还未在KP中有所报道。外排泵TetA、核糖体保护蛋白TetM、以及MFS外排泵编码基因tetL, 也被证实在一些细菌中对替加环素产生了耐药，但是在KP中未有发现。目前仅发现T-CRKP的耐药性与变异型和外排泵表达有关[27]。

3.3 结合位点突变

TGC的抗菌机制是通过可逆性结合细菌核糖体的30S亚基，干扰16S rRNA的A位点，从而阻断tRNA进入核糖体A位点，终止氨基酸进入肽链，抑制翻译过程，最终抑制细菌蛋白质的合成[28]。研究[29]发现30S亚基中的S10蛋白由rpsj基因表达，若rpsj基因发生改变就会使TGC的靶向作用位点缺失，细菌与抗菌药物的结合位点发生改变从而产生耐药。rpsj基因突变导致的细菌耐药不同于主动外排泵耐药机制，具有高度特异性，是多种细菌对替加环素耐药的靶点[30]。之后HE F等[31]通过转化互补实验不仅证实了rpsj基因突变是导致替加环素耐药的主要机制，而且为该基因的突变造成CRKP感染患者在使用替加环素治疗期间产生耐药首次提供直接的体内证据。

3.4 细菌细胞膜变异

细菌细胞膜主要由糖脂、磷脂和蛋白质3种物质构成。抗菌物质进入细菌体内主要是通过细菌膜上的膜孔蛋白，当膜孔蛋白基因发生突变时，膜孔蛋白的编码数量就会减少或其结构发生改变，细胞的通透性降低，抗菌物质因难以进入细菌体内发挥作用从而产生耐药[32]。但在大多数情况下，膜孔蛋白变异不会单独产生耐药菌株，往往与其他耐药机制共同发挥作用。此外，催化磷脂合成的酶PlsC是一种跨膜蛋白，具有渗透作用[33]。PlsC基因突变会使磷脂合成受限，细菌细胞膜的通透性降低，从而使得细菌对抗生素的敏感性减弱产生耐药[34]。

4 CR-hvKP对替加环素的耐药机制

与cKp的高耐药率相比, hvKp对抗菌药物的耐药性相对较低。目前关于hvKp菌株及其耐药性的研究相对较少，其流行病学特征及致病性存在许多不确定性。综合目前相关研究, CR-hvKP菌株的耐药机制大致分为以下2类: hvKp菌株获得性耐药或其耐药性通过获得耐药质粒产生，相关机制尚未完全明确。有研究表明, AcrB外排泵介导的耐药在hvKp菌株中也得到了证实。HUANG Y H等[35]研究发现，hvKp菌株的外排泵基因acrB及其调控基因ramA过表达，并且由于ISKpn26序列插入AcrB的负调控基因acrR和ramR中，使得acrR和ramR发生错义突变，导致hvKp对替加环素产生耐药。

5 小结与展望

近年来由于细菌对广谱抗菌药物耐药性的增加，曾被作为控制感染最后防线的碳青霉烯类抗生素用药比例大幅度上升。上述关于T-CRKP耐药机制的研究，可以为临床防治T-CRKP提供一定的参考价值。但是新型抗生素的研发上市远远比不上细菌耐药性的进展速度，因此抗生素的合理使用非常重要。临床治疗中应根据药敏结果针对不同个体采取不同的用药措施，做到有针对性的治疗，且临床医师和感控人员应强化无菌观念，尽量减少有创操作，做好全方位的感染防控工作，如加强手卫生、定期监测耐药菌感染，并实时上报、做好感染者的隔离防护等，避免院内交叉感染的发生。目前T-CRKP的耐药机制研究尚未完全明确，需进一步探究，治疗上当前可选用的抗生素包括磷霉素、庆大霉素和多黏菌素等，以及新型复合型抗生素如头孢他啶、阿维巴坦等。相信随着研究联合临床调查的深入，会出现更有效的抗生素来应对T-CRKP感染。