细胞外基质硬度调控肿瘤发展及机制研究进展

刘成涛，张小博

(江苏省南京市鼓楼区童家巷24号中国药科大学玄武门校区，江苏省肿瘤发生与干预重点实验室，江苏 南京

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0 引言

物理微环境是影响肿瘤发展的一个重要因素，由于肿瘤物理微环境的改变而引起的肿瘤细胞的生化信号改变的过程，称为机械转导(Mechanotransduction)，是一种肿瘤细胞感知和响应物理环境变化的能力[1]。物理机械转导研究的起源可以追溯到德国解剖学家和外科医生沃尔夫，他们首先提出骨重塑以响应机械负荷的变化这一概念[2]。在沃尔夫的经典论文“关于生长和形式”中，达西·汤普森 (D'Arcy Thompson) 将这种形式适应的概念扩展为结合组织和有机体的生长和发育，强调物理力和功能所起的潜在作用[3]。这种物理机械转导尤其存在于一些容易出现基质沉积的肿瘤细胞中，并且影响到肿瘤细胞的整个生命活动[4]。

机械物理微环境包括许多方面，其中基质硬度是研究较多的一个方面。目前认为肿瘤基质发生硬化的原因主要是由于细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)的沉积和重塑[5]，而且这种硬度(stiffness)的增加被认为与肿瘤的发展密切相关[6]，这是因为细胞外基质 (ECM) 的密度和组成的改变经常出现在肿瘤发展中[7]。基质硬度是机械刺激的来源之一，在结直肠肿瘤等实体瘤的多个不同分子信号通路中影响肿瘤细胞和非肿瘤细胞，导致肿瘤侵袭和转移、免疫逃避和耐药性[8]。

目前已知ECM包括许多的组成成分，其组成的不同也可能会影响到ECM的硬度，其中，胶原蛋白和透明质酸是影响其硬度的主要因素。先前的研究表明，胶原蛋白的沉积和交联以及透明质酸含量的增加会增加ECM的硬度，即基质硬度[9-11]，这种基质硬度的增加可以通过机械转导将物 理信号从ECM传递至细胞内，从而改变细胞的生物学行为[12]。目前有研究发现，胶原蛋白受体整合素和透明质酸受体CD44都参与了基质硬度的机械传导，不同亚型的胶原蛋白与整合素结合，而不同亚型的透明质酸与其受体CD44结合，调节下游的信号通路，从而产生不同的生物学效应[13]。这些ECM的组成成分既可以作为外部的结构支架发挥机械作用，也可以作为细胞信号传导的驱动器发挥功能作用，并且部分通过整合素信号传导[14]。在细胞的不断发展过程中，ECM成分可以被MMP家族蛋白降解从而重塑为新的ECM，从而为细胞的发展提供一个动态的过程。因此，ECM可以通过细胞-细胞外基质结合产生信号传导或其他机制从而成为细胞功能和组织发育的关键驱动力[15]。

目前针对基质硬度对肿瘤影响的研究中都会采用一种称为聚丙烯酰胺凝胶的模型，该模型是以丙烯酰胺和双丙烯酰胺为主体，按照不同的配比从而产生不同情况下的基质硬度值，以模拟体内不同组织或者肿瘤组织的具体硬度值，从而有利于研究的开展[16]。Robert等人很早就发现了通过在胶原蛋白涂层的聚丙烯酰胺凝胶(基质硬化模型)底物上培养正常的大鼠肾脏上皮细胞和3T3纤维母细胞可以促进细胞的扩散和运动性，表明了细胞对周围环境中物理变化的响应[17]，同时表明这种响应涉及到肌动球蛋白细胞骨架。Adam等人发现将MSC置于不同组织的基质上时，会表现出不同的分化方向：模仿大脑的软基质具有神经源性，而模仿胶原质骨的硬基质具有成骨性，并且这种分化的差异可以通过抑制非肌肉肌球蛋白II而消除[18]。在许多肿瘤的发展过程中都会出现基质硬化或者纤维化这一过程，比如乳腺癌会出现基质重塑和纤维化，而肝癌的晚期会出现明显的肝硬化和纤维化，这些癌症的机械物理微环境的变化是否会影响后续的肿瘤发展以及背后的机制研究发展有待进一步的挖掘。因此，本文将就基质硬度调控肿瘤发生发展及分子机制进行综述，为以调节基质硬度为治疗目标的思路提供理论基础。

1 基质硬度与肿瘤细胞能量代谢

能量代谢可以为细胞活动和增殖提供能量和生物必须物质，正常细胞主要通过调节葡萄糖、脂质和氨基酸代谢来满足其代谢需求[19]。而在肿瘤细胞中由于其需要满足自身快速的增殖，从而需要较多的能量供应，所以在肿瘤细胞中代谢重编程是一种常见现象，因为这种代谢重编程允许癌细胞在不同的微环境中快速获得较多的能量供应，从而实现自身的增殖与存活[20]。

目前许多的研究都发现了基质硬度在调节细胞代谢重编程中所起的作用，尤其是在肿瘤细胞中，基质硬度引起的细胞代谢重编程会影响到肿瘤多个方面。YAP/TAZ是感应机械物理微环境变化的关键分子，它们在胚胎和肿瘤的发育中起到重要作用，并且促进了细胞的增殖和存活，有研究发现基质的硬化可以通过整合素影响细胞代谢，并且据报道整合素通过 YAP/TAZ 影响细胞代谢[21]。在不同的肿瘤细胞如肝癌、乳腺癌中，基质硬度可以上调YAP/TAZ的表达，而其表达的上调会促进肿瘤细胞对葡萄糖的摄取和利用，增加糖酵解的速率，并影响糖原分解[22]。基质硬度还被证明可以通过影响硫氧还蛋白相互作用蛋白 (thioredoxininteracting protein，TXNIP) 来调节葡萄糖代谢，TXNIP可以抑制细胞对葡萄糖的摄取。最近沙利文等人的研究发现降低ECM硬度的主要组成成分透明质酸(hyaluronic acid，HA)会降低细胞内的TXNIP，同时发现HA含量的短时间降低会激活RTK信号通路并促进ZFP36表达，从而导致转录后调节和TXNIP表达降低，而HA含量的长时间降低会增加MYC信号并抑制TXNIP转录[23]。另外，最近的研究也发现组织硬度可以通过RhoA/RocK通路影响肌动蛋白细胞骨架，从而影响肿瘤细胞的代谢过程。较早的研究发现由于细胞骨架上会结合有许多与代谢有关的酶，如糖酵解酶[24]，因此基质硬度引起的细胞骨架扰动会引起如葡萄糖转运蛋白 GLUT4 向细胞膜的易位来影响葡萄糖摄取[25-26]。基质硬度的增加会引起肌动蛋白细胞骨架的聚集和收缩，帕克等人通过研究发现基质硬度引起的细胞骨架聚集会抑制含有E3泛素连接酶三方基序 (tripartite motif，TRIM) 的蛋白质 21 (TRIM21) 的迁移并且减少其作用范围来调节糖酵解酶磷酸果糖激酶 (PFK)，进而调节肿瘤细胞代谢过程[27]。同样的，研究人员还发现组织硬度可以通过增加肌动蛋白丝的密度以使醛缩酶与肌动蛋白细胞骨架以一种完全无活性的形式相互结合，从而降低人结肠癌细胞系HCT-116的糖酵解过程[28-29]。

基质硬度除了会影响到肿瘤细胞的糖酵解过程，还会影响到其他的代谢过程如脂质代谢、氨基酸代谢。在脂质代谢中，基质硬度可以通过AKT等途径上调甾醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element-binding protein，SREBP)的 表达，从而促进肿瘤细胞的脂质代谢[30-31]，进而促进细胞增殖、生长，减少细胞的凋亡。而在氨基酸代谢中，基质硬度可以调节氨基酸转移，从而影响到其代谢过程，其主要是通过上调YAP/TAZ过程实现的[32-34]。

2 基质硬度与肿瘤细胞侵袭转移

肿瘤细胞的转移是一个复杂的过程，在这个过程中，癌细胞需要从原位灶经过一系列的步骤到达各种器官即转移灶，在这些步骤中，肿瘤的细胞外基质与肿瘤细胞骨架之间的互相作用是关键。值得注意的是，来自肿瘤细胞外基质的物理微环境和生化线索会影响一些癌症标志物并调节细胞-细胞以及细胞-ECM间的相互作用，进而影响到癌细胞的侵袭和转移[35-36]。

已有大量的研究显示增加基质硬度会引起肿瘤的恶性表型，且主要与癌细胞的转移相关[37-39]，其基本特征是Rho依赖性细胞骨架张力增加，导致细胞与细胞外基质粘附增强，这些研究背后的机制主要与活化的FAK和细胞外信号调节激酶信号传导相关[40]。同时一项来自临床前的研究证明硬度与癌细胞转移至关重要，该研究表明破坏肿瘤细胞外基质的完整性会阻止转移，从而起到较好治疗作用[41]。癌细胞可以通过整合素等效应器感知细胞外基质的硬化，引起整合素的聚集，从而启动粘着斑信号分子的募集，如FAK、SRC、桩蛋白等，从而增强磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K)的活性，而这些蛋白活性的增加都与肿瘤的侵袭转移密切相关[42-44]。此外，在基于3D胶原蛋白的体外培养系统中，有研究发现细胞-细胞外基质粘附蛋白 RSU-1 在基质硬度增加的情况下其表达显着上调，并且明显增加了肿瘤细胞的侵袭能力，而由缺乏 RSU-1 的肿瘤细胞在相同的条件下并没有显示出明显的转移能力[45]。

此外，研究发现，在SMAD4突变的胰腺癌中，细胞外基质硬化与细胞内ROCK激酶活性的增加有关，而ROCK活性的增加反过来又促进了细胞外基质的产生，增加了基质的硬化过程，同时促进了粘着斑的生成和信号转导以及转录激活因子-3 (activator of transcription-3，STAT-3) 的信号激活，从而驱动肿瘤的侵袭转移[46]。研究发现在乳腺癌中，胶原蛋白交联增加导致的肿瘤细胞外基质硬化通过Integrin-PI3K促进了转移的开始[47]，通过在纤维蛋白凝胶中培养鼠B16-F1黑色素瘤细胞，尾静脉注射后发现与对照相比，其在肺中产生的转移灶更明显，致瘤性更强[48]。还有研究表明高基质硬度下的乳腺癌通过从胞质结合伴侣G3BP2释放TWIST1来促进TWIST1的核易位，从而促进肿瘤转移[49]，这种变化可能与细胞骨架发生的剧烈改变有关。

3 基质硬度与肿瘤细胞干性

肿瘤的细胞外基质是高度动态的，它会不断地经历着降解与重塑过程，其中包括各种细胞外基质成分被沉积、降解或者改变。目前越来越多的研究表明细胞外基质可以作为正常细胞或者肿瘤干细胞的生态微环境。由于细胞外基质成分的过度表达，导致癌细胞的基质相较于正常的细胞基质更加坚硬，细胞外基质的硬化赋予的机械特性通过粘着斑的形成和随后的机械转导通路的激活传递给肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)[50]。

细胞外基质的硬度在调节干细胞的自我更新和分化中起着至关重要的作用，一些研究表明细胞外基质硬度可以诱导人类间充质干细胞 (MSCs) 和神经干细胞分化成不同的细胞谱系[51-52]。有研究发现，在黑色素瘤干细胞中，三维 (3D) 软纤维蛋白基质可以促进组蛋白3赖氨酸残基9 (H3K9) 去甲基化并增加SOX2的表达和自我更新，而硬化的基质则发挥相反的作用[53]。但是在乳腺癌干细胞中，情况却是相反的，有研究发现处于较硬基质上的乳腺癌干细胞可以通过整合素连接激酶ILK增加肿瘤干细胞标志物的表达，这表明基质硬度对干性的影响是与癌症类型相关的[54]。肝癌在晚期时经常会有肝硬化的现象出现，其基质硬度要明显高于周围正常的肝组织，有研究人员发现基质硬度可以通过激活整合素β1/Akt/mTOR/SOX2这一信号通路参与干性调节过程，这项研究也揭示了一种新的调节途径来探究肝癌细胞的干性特征[55]。

4 基质硬度与肿瘤细胞耐药

肿瘤细胞的化学抗性即耐药性通常由肿瘤干细胞 (CSC) 驱动，这些肿瘤起始细胞具有良好的自我更新的能力，它们只占异质肿瘤的一小部分。化疗后的转移性复发被认为是由于肿瘤干细胞中治疗抗性的产生，因为它们普遍具有逃避细胞凋亡的能力，并且可以使肿瘤细胞在治疗结束后重新恢复活力[56]。目前发现许多不同的细胞内机制可以让癌细胞避免受到化学治疗产生的细胞毒性作用，而且这些机制都与肿瘤干细胞相关，其中主要包括药物可及性、上皮-间质转化(EMT)以及致癌信号通路[57]。

目前发现在肿瘤细胞的进展中，基质硬化可以促进肿瘤细胞的收缩性和化学抗性，同时通过各种机械转导机制促进肿瘤的进展。

(1)基质硬化与药物可及性

从目前的研究进展来看，关于细胞外基质硬度对药物进入癌细胞能力的影响的研究并不是很多，一个较为典型的研究是关于细胞色素P450的，该项研究发现细胞色素 P450 的活性会受到肝细胞底物硬度的影响，其中P450在较软的底物上会显示出比较硬的组织培养板表面更高的活性[58]。虽然关于这方面的研究较少，但是基质硬化所具有的高度纤维化的微环境会导致固体应力的积累，当这种积累超过一定的限度时会迫使血管塌陷，限制血液流动，而这种情况的出现必然会大大降低药物进入肿瘤的能力，因此可能会降低药物的可及性[59]，尽管证据较少。

(2)基质硬化与EMT

细胞外基质的硬化已经在多种肿瘤细胞中显示出其具有促进EMT的能力。在处于基质硬化微环境中的乳腺癌细胞中，有研究发现其蛋白质 Rac1b 定位于质膜上，这一定位的变化会通过促进 NADPH 氧化酶产生活性氧来促进snail的表达，进而诱导EMT的发生，并且促进了对吉西他滨的耐药性[60]。同时，基质硬度也被证明可以改变癌细胞对TGF-β的反应，其中在较软基质中显示出TGF-β诱导的细胞凋亡，而在基质硬化微环境中则显示出TGF-β诱导的EMT的发生[61]。在基质硬化微环境中被显著激活的效应器YAP也与EMT相关，进而产生耐药性，已有研究发现过表达YAP的胰腺癌细胞会通过激活AKT通路促进对吉西他滨的耐药性，这种现象的发生与YAP在基质硬化微环境下的入核有显著的关系[62]，而且这种YAP的过表达会使上述癌细胞对TGF-β的反应从细胞凋亡转变为EMT的发生。

(3)基质硬化与致癌信号通路

细胞外基质硬化会引起细胞内多条信号通路的激活，其中包括那些与细胞生存和凋亡相关的通路，因此它也可以作为化学抗性的调节剂。作为黏着斑下游的PI3K信号通路，可以在基质硬化微环境中被激活，而其背后的机制可能与小窝蛋白-1(caveolin-1)有关，它是小窝膜结构域的一种结构成分，对剪切应力(shear stress)具有机械敏感性并且可以促进乳腺癌细胞中的PI3K信号通路激活[63]。黏着斑除了可以通过上述的方式响应基质硬化微环境外，还可以通过激活MAPK信号级联反应促进细胞周期的进程以响应基质微环境的变化，而这种MAPK的级联反应又可以与Rho/ROCK信号通路发生串扰从而进一步加强这两种信号通路的激活[64]。作为另外一种重要的响应基质硬化微环境的效应器，ROCK可以被基质硬化微环境所激活，从而调节癌细胞的生存或者凋亡。ROCK通过增强细胞周期进展蛋白周期蛋白依赖性激酶2(cell cycle progression proteins cyclin-dependent kinase 2)和细胞周期蛋白E(cyclin E)的核定位以促进细胞存活，而通过激活PTEN抑制PI3K信号通路，以及激活各种半胱天冬酶以促进细胞凋亡[65]。

5 结语

基质硬度作为一种重要的肿瘤微环境，它已经显示出对肿瘤多个方面产生影响的潜力，进而影响到随后的肿瘤细胞行为。对于处于不同基质微环境中的肿瘤，不同的行为显示出癌细胞对该微环境的正确响应，进而做出一系列的生化信号以应对这种环境的改变。

细胞外基质是由许多成分组成的，这些成分大多数是癌细胞表面蛋白的受体，它们之间的结合会将胞外的机械物理信号通过机械转导转变为胞内的生化信号，指导细胞的生存、增殖、运动及转移等行为。癌细胞在不同的发展过程中可能需要不同的生存微环境，这就表明这种机械物理信号不是一成不变的，而是动态变化的，癌细胞可能会随着发展状态的变化不断的重塑改变着细胞外基质，进而为癌细胞自身的生存创造一个良好的生态微环境。

尽管目前对于基质硬度影响肿瘤多个方面的研究已经较为全面和深入，比如对基质硬化响应的效应器YAP或者ROCK的研究已经非常成熟，但是对于这些繁多的效应器以及非常多的影响领域并没有一个较为统一的说法，在不同的癌细胞中可能会有不同的影响效果甚至得出完全相反的结论，这就非常不利于理论研究的开展以及临床上的应用。所以未来的关于基质硬度的研究很有必要在不同的癌细胞中找出相似的理论，从而建立起一种较为广泛的理论体系。