胰腺癌患者脱氧胞苷激酶(dCK)蛋白表达与吉西他滨 化疗敏感性的关系

荆鑫，张强

(内蒙古医科大学附属医院 肝胆外科，内蒙古 呼和浩特 010000)

1 吉西他滨与脱氧胞苷激酶的作用过程

吉西他滨(2'，2' - 双氟脱氧胞苷，GEM)是细胞周期特异性的DNA合成、修复抑制剂，属于胞嘧啶核苷衍生物，也属于代谢物抗癌药，其抗癌作用通过细胞的吸收及磷酸化。它主要作用于脱氧核糖核酸合成阶段的肿瘤细胞，通过抑制肿瘤细胞从g1向S的发展，限制D脱氧核糖核酸复制和细胞分裂。吉西他滨转运至肿瘤细胞内发挥抑制脱氧核糖核酸复制作用需要借助肿瘤细胞膜的多种人核苷转运体(hNTs)，这些人核苷转运体主要包括钠依赖型(hCNT)和钠非依赖型(hENT)。吉西他滨作为临床一线化疗用药，长期在胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌等恶性肿瘤的临床治疗中发挥作用[6]。

在细胞中，吉西他滨依赖于脱氧胞苷激酶(dCK)的作用才能发挥癌作用的发挥，这是一种重要的代谢调节因子，可催化很多种特定底物水平磷酸化。它作为脱氧胞苷激酶磷酸化反应的良好底物，经脱氧胞苷激酶磷酸化后，吉西他滨主要生成了三种磷酸化下游产物。作为DNA复制过程中的重要原料，脱氧核苷酸需要通过核苷酸还原酶还原而产生，然而核苷酸还原酶的活性可以被吉西他滨二磷酸盐抑制，从而使脱氧核苷酸的产生减少，进一步负反馈抑制作用被逆转，导致更多的吉西他滨三磷酸盐的积聚。同时三磷酸盐可以直接抑制脱氧胞苷脱氨酶，进而使更多的单磷酸盐转化成活性代谢产物二磷酸盐和三磷酸盐，这些活性产物又通过上述方式来抑制肿瘤细胞DNA的复制，进而发挥它们的抗癌作用[7]，除此之外，活性产物三磷酸盐也可利用自身特有的“掩蔽链”作用，达到干扰肿瘤细胞DNA自我修复的目的，进而阻碍肿瘤细胞的DNA合成，DNA链断裂，最终杀死肿瘤细胞[8]。有研究证明癌症患者体内如果脱氧胞苷激酶表达量下降、活性降低甚至于基因缺失则会导致细胞内核苷酸库失去平衡，从而导致肿瘤细胞产生耐药性，会降低核苷类药物的抗癌效用[9]。因此，脱氧胞苷激酶被认为是吉西他滨和其他核苷药物体内代谢的关键酶，对此类药物发挥抗癌效用起着十分关键的作用。

2 基因的遗传多态性与吉西他滨及其他核苷类药物化疗耐药性的相关性研究

单核苷酸多态性(SNP)是指因为基因组水平上单核苷酸变异而造成的DNA链断裂，最终导致肿瘤细胞死亡。序列多态性属于人类最常见的遗传和变异类型之一。由于它可以影响基因的表达及其对应蛋白的合成，所以SNP在影响人体对药物的代谢反应中的作用越来越受到医学界的重视。近年来，有学者发现核苷类抗肿瘤药物代谢关键酶(dCK)的多个相关SNP位点可影响其基因的表达及其对应蛋白的合成，从而影响该类药物对肿瘤细胞的复制和生长的抑制作用，削弱其抗癌疗效。所以某些SNP位点有可能用来预测核苷类药物效用。

对于脱氧胞苷激酶(dCK)来说，其SNP可以位于非编码区或编码区，可以各自影响其基因表达以及对应蛋白的合成和活性，最终影响该代谢关键酶的效用。近年来，随着临床对药物代谢过程和基因组学不断深入的研究，人们逐渐认识到药物代谢酶的单核苷酸多态性可能是个体出现作用差异的主要因素，愈来愈多的证据表明抗肿瘤药物代谢关键酶dCK基因的遗传多态性是使癌症患者在化疗过程中敏感程度不同的原因之一，有报道称与核苷类药物代谢有关的酶的SNP的改变可引起药代动力学和毒性之间的个体差异[10]。因此，寻找影响吉西他滨等化疗药物基因表达或蛋白质合成及活性的关键SNP位点，相当于寻找这些化疗药物的化学敏感性遗传标记。在临床上对患者实现预测化疗药物敏感性的目的，从而实现对癌症患者的个体化治疗，显著提高患者预后。

脱氧胞苷激酶(DCK)包含7个外显子，该基因在人类第4号染色体上，其相对分子质量为34kb，它主要通过磷酸化脱氧胞苷及其类似物来在癌症治疗中发挥的抵抗作用。有研究发现在在急性髓细胞性白血病(AML)的化疗中所采取的1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶(AraC)的细胞毒活性受dCK磷酸化代谢的影响，从而影响其化疗效果[11]。目前，许多研究表明多个dCK基因的SNP位点与核苷类化疗敏感性有关。通过检测dCK基因的SNP位点可以预测化疗的敏感性。

自发现SNP位点的遗传多态性在核苷类药物化疗中的重要影响以来，有越来越多的医学研究者在这一领域想要探索出更明确的方向，2004年，陈竺等人的研究小组对不同种族的人群进行了dCK基因测序，鉴定出十三种之前没有被发现的单核苷酸多态性(SNP)位点，最终确认了7种，这7个SNP位点就是关于影响dCK基因或蛋白活性改变的SNP位点。在122项针对急性白血病患者的dCK基因研究中，Mank-Seymour发现C-360G和C-201T这两个SNP位点的基因遗传频率较高。同时拥有基因型-360CG/-201TT患者对核苷类药物的敏感性高于基因型-360CG或基因型-201TT的患者，前者dCK基因转录水平较高，因此两个SNP位点-360CG/-201 TT与核苷类药物反应相关。证实了SNP位点的遗传多态性在核苷类药物化疗中重要作用[12]；2007年，Lamba等人在人类DNA样本中研究了他们的欧洲和非洲祖先的dCK基因，发现这些样本中dCK基因的启动子和外显子区域存在C356G和C364T SNP突变，而这些SNP位点的突变与dCK的活性降低有关。此外，Lamba J等人还发现了dCK基因的表达在非洲人群中相较北欧和其他后裔人群更高更广泛[13]。Joerger等人[14]发现了dCK基因的C364 T SNP突变位点与dCK的酶活性的降低和dCK相关蛋白表达水平下降有紧密联系；2008年Kocabas[15]等通过对人的240个DNA样本重测序来研究dCK和CMPK基因的遗传多态性，发现了dCK基因中A70G和C364T两个SNP位点的突变与dCK的蛋白表达和dCK酶活性的降低密切相关，因此为通过检测SNP位点预测胰腺癌患者核苷类药物化疗疗效给予了方向；Rivero[16]针对74例正在使用吉西他滨化疗方案的滤泡性淋巴瘤患者进行dCK基因的多态性检测，发现了那些C28624T SNP位点发生改变的癌症患者在化疗后出现了不同的副作用，提示可以利用检测dCK基因SNP位点的突变来预测胰腺癌患者吉西他滨化疗的预后情况。Okazaki等人[17]发现细胞可以在化疗期间对吉西他滨产生抗性，其中机制之一是决定吉西他滨在细胞内的吸收的核苷转运蛋白—人平衡核苷转运蛋白-1(hENT-1)表达水平的降低引起的，可以引起dCK基因A727C SNP突变位点，从而影响胰腺癌患者的化疗疗效；因此，我们的研究和分析表明，吉西他滨的化疗敏感性与肿瘤组织中dCK的表达密切相关。其中，dCK高表达的患者采用以吉西他滨为主的化疗方案治疗时可以有更好的效果。

此外，研究人员还针对临床上接受吉西他滨化疗的胰腺癌患者，采取了他们接受吉西他滨化疗前的肿瘤组织样本和他们接受化疗后的肿瘤组织样本的生存时间做了相关性分析，结果表明肿瘤组织中dCK蛋白的含量与患者的化疗后生存期关系紧密，dCK蛋白表达水平越高，生存时间越长[18]。以上这些研究发现都为利用检测dCK基因SNP位点来预测胰腺癌患者吉西他滨化疗敏感性提供了依据。

3 脱氧胞苷激酶(dCK)蛋白表达与吉西他滨化疗敏感性的关系

脱氧胞苷激酶(dCK)广泛存在于人体组织和细胞中，属于一种代谢酶，它可以使人体的核苷酸库保持平衡，并催化多种特异性底物的磷酸化，如嘧啶和嘌呤脱氧核苷，包括重要的抗病毒药物和细胞生长抑制药物等。吉西他滨就是dCK磷酸化的良好底物之一，吉西他滨通过细胞膜上的人核苷转运体进入细胞，继而被dCK分步磷酸化，而其产生的磷酸化产物，可以通过许多种方式来抑制肿瘤细胞中DNA的复制及合成，化疗药物就达到了它的抗肿瘤作用。吉西他滨在体内发挥抗肿瘤效用的过程中脱氧胞苷激酶在其中起到了不可或缺的作用，扮演了化疗药物活化过程中限速酶的角色[19]。

介于dCK在核苷类药物的抗肿瘤效用中扮演了不可或缺的作用，那么我们当然可以猜想dCK活性的改变会直接影响到这一类化疗药物的化疗效果。Hubeek等人[20]利用了118个儿科组织样本(包括多种癌症)研究脱氧胞苷激酶蛋白的表达水平，这些样本包括病理切片和组织细胞等成分等，发现不同癌症患者脱氧胞苷激酶蛋白的表达情况不相同，除此之外他们还发现患有同一种癌症病人的脱氧胞苷激酶蛋白的表达水平也存在个体性差异，进一步证实了临床癌症患者体内脱氧胞苷激酶蛋白的表达水平与阿糖胞苷等化疗类药物的敏感性相关。

综上已经可以看出目前医学界对癌症患者体内dCK基因及其编码蛋白的表达与核苷类药物的化疗疗效的相关性的初步探索已经有很多，期望通过发现他们之间的相关性来实现预测胰腺癌患者接受吉西他滨化疗疗效的目的。Kroep等[21]建立了包括胰腺癌、肺癌、膀胱癌等七种小鼠的肿瘤模型，并开展了吉西他滨化疗敏感性的检测，也测定了dCK酶的活性程度、dCK的mRNA表达水平和蛋白表达水平，结果显示dCK是吉西他滨敏感性的重要预后标志物，其蛋白质水平与dCK活性(P＜0.001)和吉西他滨敏感性(P＜0.001)均显著相关；Hapke等人[22]通过用含有dCK或LacZ cDNA的逆转录病毒载体LNPO感染三个肿瘤细胞系MCF-7，HT-29和H1437并测量了对核苷类似物的相应敏感性证明了在体外致敏的实体肿瘤细胞中转染dCK基因可能是治疗这些恶性肿瘤的有用辅助手段；Blackstock等人[23]通过高效液相色谱(HPLC)和氟19磁共振波谱(F-19 MRS)检查了HT-29人结肠癌异种移植物中裸鼠中dFdCyd/dFdCTP 的摄取和清除情况，发现dCK异种移植物在吉西他滨治疗后敏感性增强，表现出明显的肿瘤生长延迟；Ricci等人[24]通过对44例胰腺癌患者手术切除的标本进行免疫组化染色，结果显示dCK蛋白的表达程度与吉西他滨化疗患者的年龄、性别、OS和DFS有密切的关系，并且显示出一系列的标记强度，范围从1+到3+，认为dCK蛋白是一种与胰腺癌吉西他滨化疗疗效有关联的标志物，吉西他滨治疗后dCK表达降低，总体生存率提高，另外该团队还发现dCK蛋白主要集中于细胞核中，而先前的研究者则通过对44例胰腺癌患者的脱氧胞苷激酶(dCK)进行免疫组织化学评估，结果发现44例中有40例dCK阳性，并且dCK表达低与年龄增长，女性，以及患者总体生存率下降显著相关，且指出dCK蛋白在细胞质中的定位部[25]。Stegmann等人[26]将野生型脱氧胞苷激酶(dCK)cDNA转染到克隆来源的阿糖胞苷(AraC)和地西他滨耐药的大鼠白血病细胞系中，结果显示可完全恢复药物敏感性；Manome等人[27]发现逆转录病毒和腺病毒载体介导的dCK的cDNA的转导均导致神经胶质瘤细胞系对ara-C的体外细胞毒性的敏感性提高，用dCK转导的已建立的皮内和脑内神经胶质瘤的ara-C治疗可在体内产生显著的抗肿瘤作用；Marechal等人[28]进行的dCK蛋白表达相关的免疫组化检测，认为dCK蛋白的表达与胰腺癌患者的术后生存率和无瘤生存率有关，可作为独立的预后预测因素。

然而上述研究中多采用生存时间和总体生存率对胰腺癌患者核苷类药物化疗敏感性评估，用两个同一类的评估指标去评估吉西他滨化疗敏感性说服力不足，因为在临床治疗中由于癌症患者的生理机能、免疫功能等存在个体化差异，这些个体化差异也会导致患者对化疗药物的敏感性出现差别，故不能单纯靠生存率和生存时间来精准预测吉西他滨化疗对于胰腺癌患者作用的敏感性。且目前关于此类课题的研究中缺少探讨dCK蛋白通路下游的详细调控机制，关于dCK基因及蛋白表达是如何来影响吉西他滨等核苷类药物的敏感性的具体机制没有进行深一步的研究，这也为以后的探索提供了方向。