环曲病毒研究进展

2022-12-06崔志军于萌萌魏丽丽

畜牧兽医科技信息 2022年5期

郭炜，崔志军，于萌萌，魏丽丽★

（1. 内蒙古通辽市动物检疫技术服务中心，内蒙古通辽 028000；2. 内蒙古赤峰市红山区农牧水利局，内蒙古赤峰 024000；3. 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江哈尔滨 150000）

环曲病毒（Torovirus）是有包膜的正链RNA 病毒，可引起动物和人类肠道、呼吸道甚至全身感染。人类认识环曲病毒的历史较为简短：第一株马的环曲病毒（EToV）是于1972年在瑞士从一匹腹泻的马死亡前一周的直肠拭子中分离出来。在发现EToV7年后，研究者在爱荷华州的一个奶牛群中通过电子显微镜（EM）在患有严重腹泻的小牛粪便样本中发现了形态相似的颗粒，将其定义为牛环曲病毒（BToV）。除了已确定的马和牛的环曲病毒外，研究者通过EM在不同动物物种中发现了类环曲病毒颗粒(TVLP)。环曲病毒同样能感染人类和猪，是人畜共患病。本文主要从环曲病毒的分类、理化特性、地理分布、流行病学、发病机制及临床特征进行多方面的阐述。

1 分类地位

环曲病毒（Toroviruses）是有包膜的正链RNA病毒。1992年以来，根据其基因组和复制方式将环曲病毒属列入冠状病毒科，因此冠状病毒基因、mRNA 和结构蛋白的命名法也应用于环曲病毒。然而，由于结构基因缺乏序列同源性，与冠状病毒缺乏抗原亲缘关系，环曲病毒作为一个单独属分类。国际病毒分类委员会(ICTV)目前将环曲病毒属分为四类：马环曲病毒（Equine torovirus，EToV）、牛环曲病毒（bovine torovirus，BToV）、猪环曲病毒（porcine torovirus，PToV）和人类环曲病毒（human toroviruses，HToV）。

2 病毒粒子特点

环曲病毒粒子具有一个螺旋对称的核衣壳，缠绕成一个空心管(直径23nm，平均长度104nm，周期性4.5nm)。环曲病毒粒子直径通常为12～40nm。它们可形成球形或椭圆形或棒状病毒粒子，其形状取决于病毒粒子相对电子束的不同方向。环曲病毒粒子被一个约11nm 厚的包膜包围，具有突出的鼓形柱（17～24nm）和边缘较短的尖（8～10nm）。在细胞内，环曲病毒末端为圆形的细长小管，位于受感染的肠细胞的胞质中。

3 环曲病毒编码的蛋白质

在EToV 病毒粒子中已鉴定出分子量分别为20、22、37 和80～100kDa 的蛋白。洗涤剂处理后的病毒粒子释放出22、37 和80～100 kDa 蛋白，这表明它们与包膜蛋白相关。通过表面放射性碘化技术，在纯化的BToV 中也鉴定出了20、37、85 和105 kDa 的类似多肽。N 蛋白（167aa）是在病毒粒子中发现的最丰富的多肽（80%～84%），预测分子量为18.3～19.2 kDa。M糖蛋白（233aa，26.5kDa）是第二丰富的蛋白质（13%），可能与包膜有关。应用计算机分析揭示了一个III 类膜蛋白的特征，它缺乏一个被切割的信号序列，但在N 端包含3个连续的跨膜α螺旋。M蛋白在细胞膜内积累，在出芽过程中的组装、成熟和核衣壳识别中发挥作用。异质N- 糖基化S 蛋白（80～100 kDa），编码一个分子量的载脂蛋白（1581aa），包含典型的I 型膜糖蛋白的典型结构域：一个N 端信号序列，一个假定的C 端跨膜锚点和一个细胞质尾巴。环曲病毒HE 蛋白（65kDa）是一种具N- 糖基化的蛋白，位于环曲病毒的包膜中，它有一个N 端信号序列，一个C 端跨膜结构域，几个N-糖基化位点和一个假定的“FGDS”基序。BToV 和PToV 的HE 蛋白以N- 乙酰-9- 乙酰神经氨酸作为第二受体。EToV 病毒粒子缺乏HE 蛋白，仅在ORF4 中拥有部分序列。

4 环曲病毒的物理特性

EToV 在环境中非常稳定，对磷脂酶C、胰蛋白酶、糜蛋白酶甚至脱氧胆酸盐具有相对抗性，然而，TritonX100 和有机溶剂可破坏其传染性。EToV 在广泛的pH 范围内保持稳定，仅在pH2.5 以下或pH10.3 以上失活。BToV1 似乎不如EToV 和BToV2稳定，在-70℃环境下长时间储存后，可以观察到其沉积和密度的变化。据报道，含有BToV1 的粪便制剂传染性在3～4 周后完全丧失，而EToV 在无细胞上清液中能够稳定保持92d。纯化后BToV2 病毒经反复冷冻和解冻循环后会导致病毒粒子解体。

5 地理分布

研究者利用ELISA、RT-PCR 和免疫电镜（IEM）方法在奥地利、比利时、巴西、加拿大、哥斯达黎加、法国、德国、英国、匈牙利、日本、韩国、荷兰、新西兰、南非、美国等地牛的粪便样本中检测到BToV，表明BToV 可能会在世界范围内发生。序列分析表明，巴西、欧洲和亚洲的BToV 与北美毒株的同源性较高，但与北美毒株的同源性较低。在瑞士进行测试的大多数成年马都具有对EToV 的中和抗体。HToV 似乎发生在巴西、加拿大、法国、英国、印度、荷兰和美国。研究者在奥地利、比利时、加拿大、中国、匈牙利、意大利、韩国、南非、西班牙、荷兰和美国等农场的猪粪便标本中检测到PToV。到目前为止，TToV 仅在美国有报道。

6 宿主范围

研究者在马、牛、山羊、绵羊、猪、兔子和野生小鼠的血清中发现了对EToV 的中和抗体，但在人类或食肉动物中没有发现。BToV 的宿主范围似乎仅限于牛。在腹泻儿童和成人的粪便中观察到TVL 颗粒，但在添加抗BToV 小牛血清后，它们可以聚集，同时可以使用BToV 抗原捕获ELISA 进行检测，并且BToV 抗血清可以抑制大鼠红细胞的血凝集。这些观察结果表明，HToV 和BToV 之间存在抗原交叉反应性，表明两者之间可能存在人畜共患联系。

7 抗原特性

除了典型的环曲病毒形态外，BToV、EToV、HToV、PToV 具有共同的抗原。目前，只分离出一株EToV。但研究者报道了两株BToV。其中一株毒株在俄亥俄州一只5月龄腹泻小牛的粪便中检测到的，第二株（爱荷华毒株）是从一只2日龄的实验动物体内发现。基于它们在ELISA、IEM和大鼠/小鼠红细胞中血凝/血凝抑制（HA/HI）试验中的交叉反应性，这两个分离株具有两种血清型：BToV1，BToV2。ELISA、IEM、HI 和免疫印迹法证实BToV 和HToV之间存在抗原交叉反应，表明两者关系密切。一些研究者报道，在持续性腹泻患者中检测到的HToV颗粒，其形态与BToV 相似，可被BToV 抗血清凝集，当使用BToV2 抗血清时，可观察到更强的反应。因此利用BToV 的高免疫血清特性，可利用ELISA和IEM检测人类的环曲病毒。

8 流行病学

几项流行病学研究表明，BTo 抗体在几个不同的牛群中具有很高的血清流行率，这表明该病毒可能在这些牛群中频繁传播。利用ELISA/RT-PCR 方法，研究者在牛的胃肠炎病例中也检测到了BToV。这些病例中高达44%的BToV 阳性样本不含其他主要肠道病原体。4月龄以下的犊牛极易发生由BToV引起的腹泻，尤其是3 周龄以下的犊牛。BToV 间歇性释放可发生在犊牛出生后的前10个月。在犊牛体内循环的母体BToV 特异性抗体的水平会影响感染的临床结果。

在荷兰和西班牙进行的流行病学研究也显示，成年母猪中PToV 抗体的血清阳性率很高（81%和100%）。新生儿通过初乳的方式从母体获得抗体使得其血清呈阳性。之后，随着断奶年龄增加，其抗体滴度下降到接近或低于ELISA 临界值。此时，断奶仔猪感染PToV 后，其抗体效价增加。

据报道，在一项调查病毒性胃肠炎的研究中，HToV 是主要病原体。特别是在医院内病毒性胃肠炎调查中，HToV 是最常见的病原体（67%），其次是轮状病毒占19%，腺病毒为9%，诺如病毒为4.2%，星状病毒占1.4%。医院内HToV 感染的儿童（年龄3 岁）明显高于医院内轮状病毒感染的儿童（年龄6个月）。儿童医院内HToV 感染不受季节性影响，而轮状病毒感染在冬季流行。

9 传播

有研究者认为，BToV 的传播是通过口/ 鼻途径，通过直接接触受污染的粪便或鼻咽部分泌物来完成感染。在实验条件下，口服接种BToV 可引起腹泻，病毒在粪便中释放。鼻途径是另一种可能的进入途径，在饲养场犊牛的鼻分泌物中检测到BToV抗原和病毒RNA。牛冠状病毒（BCoV）的呼吸道感染发生在肠道感染之前，表明这一传播途径可能在肠道病毒的传播和发病机制中具有重要意义。BToV有可能像BCoV 一样，最初可以在鼻上皮细胞中复制，而在被吞下并感染肠道之前进行扩增。BToV 双向性假说及其在病毒发病机制中的作用有待进一步研究。

10 发病机制及临床特征

所有BToV 毒株都具有致病性，导致实验和自然感染的犊牛轻度大量腹泻。BToV 暴露24～72h后，观察到初始临床症状（轻度发热、抑郁、虚弱和厌食），随后是黄绿色至亮黄色的水样腹泻，持续3～5d。小牛可能会出现严重的脱水并死亡。感染24～72h 后，粪便病毒开始释放，与腹泻的发作相一致，并持续2～6d。在感染后3～4d 达到病毒释放高峰。与其他肠道病毒的混合感染，如轮状病毒或星形病毒，会导致比单独由任何一种病毒引起的更严重的水样腹泻。肠道菌群正常的乳糜犊牛的腹泻通常比转基因犊牛更严重。散发性和复发性BToV 释放可持续4个月。在鼻部样本中也检测到了BToV。BToV 在呼吸道中的复制和释放及其在呼吸病理中的作用有待进一步研究。

EToV 血清转化发生在10～12个月大的马身上，没有出现症状。迄今为止，对马进行的口腔感染实验尚未见报道。EToV 在病毒产生高峰后诱导受感染细胞凋亡。这由参与细胞凋亡过程的死亡受体和线粒体途径介导。EToV 诱导的细胞凋亡可促进病毒在体内的传播，并促进病毒的复制。

多项研究表明，HToV 感染与儿童腹泻有关。在一项研究中，35%的肠炎儿童在粪便中排出了HToV，但只有14.5%的无症状对照组排出了病毒。受感染的儿童出现水样腹泻，每天呕吐3～4次，最后导致出现脱水，既没有发烧，也没有发现其他肠道病原体。免疫功能低下的儿童似乎更容易感染HToV 而引发疾病。

11 病理和组织病理学

犊牛BToV 的靶器官是小肠的下半部分和整个大肠，特别是螺旋结肠。通过肉眼几乎观察不到感染症状。组织学检查显示从空肠中部到小肠下部随机分散的区域以及大肠坏死的区域有绒毛萎缩和上皮脱屑。免疫荧光检测显示，隐窝细胞和绒毛上皮细胞均含有抗原。结肠黏膜的再吸收能力丧失导致水样腹泻与小肠吸收不良。穹顶上皮细胞（M细胞），显示出与绒毛吸收细胞相同的细胞病变变化。病毒粒子存在于小肠和大肠以及基底和侧质膜的肠细胞之间。在固有层的巨噬细胞中，研究者发现了处于不同降解阶段的病毒粒子。在感染后48h，受感染区域下部绒毛和隐窝的上皮细胞以及穹顶上皮中可检测到相应抗原。研究者通过荧光检测发现细胞质中具有荧光强度（虽然少数细胞核可能有微弱的染色），通常在肠道中最为明显，组织损伤最小。空肠中部首先被感染，感染最终到达大肠，IF 诊断应优先对腹泻发病后死亡的犊牛的大肠切片进行检测。