臭氧疗法治疗神经系统疾病的作用机制研究进展

孙 闻，徐龙河 综述 刘永哲 审校

臭氧疗法是一种无创、无不良反应、低成本治疗方法，适当浓度和剂量的臭氧可与脂质等相互作用，产生可控的氧化应激作用，从而增加内源性抗氧化剂，增强局部血流灌注和氧供，具有抗炎、镇痛、营养和免疫调节特性[1-3]。近年来，臭氧疗法已广泛应用于许多疾病，如慢性皮肤溃疡、口腔疾病、感染伤口、缺血性疾病和关节问题[4-6]。在神经系统疾病中，臭氧也表现出了良好的保护效应[7]。本文综述了臭氧对神经系统疾病作用机制的研究进展，旨在为臭氧疗法的安全性和有效性提供借鉴和帮助。

1 对神经系统疾病的抗炎作用

1.1 神经炎症 是中枢神经系统(central nervous system, CNS)在损伤、感染、毒素等各种影响内稳态因素的刺激下产生的复杂免疫反应，持续存在的神经炎症是神经系统疾病，如神经发育、神经退行性和精神性疾病的病因和病程的共同特性[8]。以往的研究表明，臭氧可能通过免疫调节和激活细胞代谢起到长期持久的抗炎作用，减轻炎症反应[9]。

有学者证实，臭氧可通过抑制神经炎症治疗神经系统疾病[10]。基于大鼠慢性神经根炎模型，Wang等[11]发现鞘内注射臭氧可以缓解机械性异常痛、减弱性神经根炎，下调脊髓肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和IL-6的过表达，增加环磷酸鸟苷和环磷酸腺苷的表达。此外，使用浓度为20 μg/ml的臭氧效果优于10或30 μg/ml，鞘内给予20 μg/ml臭氧可逆转慢性神经根炎大鼠脊髓磷酸二酯酶2A和核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)/p65 mRNA蛋白表达水平升高的趋势。因此，臭氧可能是抑制神经炎症有效的治疗手段。

通过建立大鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebralartery occlusion, MCAO)模型并用臭氧(2 mg/kg)干预发现，臭氧可显著提高MCAO大鼠的存活率，降低大鼠脑含水量及神经功能评分，控制缺血大鼠的脑梗死[12]。NF-κB在脑缺血时被激活，可导致MCAO大鼠神经炎性损伤和神经元凋亡，臭氧通过降低Toll样受体4(Toll-like receptor 4, TLR4)、IκB激酶β(IKKβ)、IκB激酶α(IKKα)和NF-κB/P65的表达水平来抑制NF-κB信号通路，研究结果也提示，臭氧可通过抑制神经炎症来治疗脑卒中。

1.2 卒中后抑郁(post-stroke depression,PSD) 是脑卒中的主要并发症之一。研究表明，PSD可能对30%脑卒中患者的恢复产生影响。赵冬凤等[13]对120例PSD患者实施臭氧自体血治疗2周后，试验组血清超敏C反应蛋白(hypersensitiveC-reactiveprotein，hs-CRP)水平及汉密尔顿抑郁量表(Hamilton depression scale, HAMD)评分均低于对照组，且hs-CRP水平与HAMD评分呈正相关。随访1个月后显示，试验组临床疗效优于对照组。表明臭氧治疗可能通过降低患者hs-CRP水平，改善炎性反应对血管内皮的损伤，稳定机体的内环境，缓解抑郁症状，提示臭氧治疗对早期PSD的治疗有效。

1.3 多发性硬化症(multiple sclerosis,MS) 是一种导致脱髓鞘和轴索损伤的CNS慢性炎症性自身免疫性疾病，确切的病因尚不清楚[14]。调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)频率和功能障碍可导致炎症和疾病进展，臭氧疗法作为一种潜在的治疗方法，可调节MS患者的免疫系统反应和炎症反应。Tahmasebi等[15]通过臭氧自血疗法治疗20例复发缓解型MS患者，为期6个月。与治疗前相比，臭氧治疗后患者Treg细胞数量、叉状头/翅膀螺旋转录因子(Foxp3)、miRNAs(miR-17和miR-27)、IL-10和转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)表达水平均显著升高，显著降低了患者miR-146a的表达水平。并且臭氧治疗提高了MS患者Treg细胞的频率及其相关因素。因此，臭氧治疗对MS患者有益。此外，Delgado-Roche等[16]通过臭氧直肠吹入治疗28例复发缓解型MS患者，发现臭氧可减少促炎细胞因子TNF-α和IL-1β水平，增加MS患者单核细胞中蛋白激酶CK2的表达和核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor2, Nrf2)的磷酸化，提示臭氧的抗炎作用可能与Nrf2磷酸化和活化的诱导部分相关，臭氧疗法是MS患者的潜在治疗选择。

2 对神经系统的抗氧化应激作用

神经系统疾病的致病因素大都涉及到氧化应激，如自由基增多和脂质过氧化物的聚集等。活性氧(reactive oxygen species,ROS)与神经元损伤和神经传递异常有一定关系[17]。研究表明，臭氧可促进氧化预处理，可通过增强内源性抗氧化剂的产生、改善局部血液循环和调节免疫反应来逆转慢性氧化应激[18]。

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是发生于老年人的CNS变性性疾病，其特征性运动功能障碍是由黑质中多巴胺(DA)神经元的丧失和纹状体DA的消耗引起的[19]。在6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine, 6-OHDA)诱导的小鼠PD模型中，邓兵梅等[20]发现，连续直肠吹入5 ml臭氧 15 d，对6-OHDA诱导的大鼠中脑黑质区脑组织氧化损伤具有保护效应，使黑质部位谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性升高，丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量降低。提示臭氧可能是一种有效的治疗PD的方式。

基于快速眼球运动睡眠剥夺模型，税云华等[21]使用浓度为30 μg/ml的臭氧与2 ml大鼠尾静脉血按1∶1混合3～5 min后从尾静脉输回体内(1次/12 h，共3 d)，干预72 h时发现，臭氧组大鼠觉醒期减少，慢波睡眠、快波睡眠及血清褪黑素水平增加，且大鼠超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)水平、MDA水平降低，GSH-px水平增高，表明臭氧对于调节睡眠剥夺大鼠睡眠时相、降低体内氧化应激水平具有积极意义。

Karademir等[22]探讨了腹腔注射臭氧联合胰岛素对糖尿病大鼠颅脊髓神经病变的治疗作用。大鼠诱导糖尿病后，测定总氧化状态(total oxidation state,TOS)和总抗氧化状态(total antioxidant state,TAS)，计算氧化应激指数(oxidative stress index,OSI)，取脑组织和脊髓组织进行组织病理学检查。结果显示，臭氧组、胰岛素组及臭氧联合胰岛素组与对照组相比，TAS较高、TOS和OSI较低、轴突退变和血管充血的病理改变较小。这表明臭氧结合胰岛素可刺激糖尿病神经病变的内源性抗氧化防御机制，从而预防ROS诱导的损伤，对颅脊髓神经病变有保护作用。

3 对神经系统的抗细胞凋亡作用

大量研究表明，退行性变疾病与细胞过度凋亡密切相关，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)在细胞凋亡中起关键作用[23-25]。

Cai等[23]通过构建神经元SH-SY5Y细胞缺血-再灌注损伤(ischemiareperfusion injury,IRI)模型并进行臭氧预处理发现，臭氧通过增加GSH-Px、SOD、过氧化氢酶(catalase,CAT)和减少MDA来减轻氧化损伤。臭氧降低了SH-SY5Y细胞IRI引起的线粒体损伤，抑制了细胞色素C从线粒体向细胞质的释放，并且通过增加SH-SY5Y细胞中凋亡相关基因Bcl-2/Bax比值和抑制caspase信号通路来减少细胞凋亡。表明臭氧具有维持氧化还原稳态、减轻线粒体损伤、抑制神经细胞凋亡的作用。Wu等[24]建立了化学神经根神经炎大鼠模型并给予1 mg/(kg·d)臭氧治疗。发现臭氧显著减少了模型大鼠中自噬体的形成，抑制了神经根细胞的自噬。与模型组相比，臭氧显著降低了自噬标志因子LC3B的水平和裂解的caspase3的表达，缓解了神经根细胞的凋亡，抑制了LC3B和自噬相关基因Beclin1的表达。

臭氧治疗对新生大鼠缺氧缺血脑损伤(hypoxia-ischemia brain injury,HIBI)有一定影响。文献[25]对7日龄雄性Wistar大鼠，随机分为假手术组、对照组、臭氧处理组(分为低剂量组1 mg/kg和高剂量组2 mg/kg)。除假手术组外，其余大鼠均置于缺氧室中，结果表明臭氧治疗组大鼠右半球凋亡神经元数明显少于对照组，且臭氧高剂量组凋亡神经元数更少。臭氧高剂量组Morris水迷宫试验结果与假手术组相似。研究结果提示，臭氧治疗可以降低HIBI新生儿大鼠的神经元凋亡，改善了认知功能，表明臭氧可以通过抑制细胞凋亡来延缓神经系统疾病的进展。

4 保护神经及促进神经再生作用

4.1 肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS) 是一种无法治愈的致命神经退行性疾病，其中进行性运动神经元丢失和炎症反应是主要的病理学标志[26]。目前用于研究ALS的动物模型，技术最成熟、应用最广泛的是铜锌超氧化物歧化酶-甘氨酸93丙氨酸(copper zinc superoxide dismutase 1-glycine to alanine mutation at position 93，SOD1-G93A)转基因小鼠模型。Bette等[27]建立SOD1-G93A小鼠模型，研究了为期5d的臭氧腹腔注射治疗方案的治疗潜力。对SOD1-G93A小鼠的临床评估显示，在终末期SOD1-G93A小鼠的脑干中，臭氧治疗可减慢神经退行性变，使三叉神经运动核中与SOD1相关的空泡化减少。此外，脑干中的小胶质细胞增殖不明显，而星形胶质细胞的肥大基本上没有受到影响。在SOD1-G93A小鼠出生后第60天，血液、脾脏和肠系膜淋巴结中的单核细胞数量减少。并且臭氧还可以减少疾病晚期SOD1-G93A小鼠的肠系膜淋巴结中的单核细胞数量。总的来说，该研究揭示了臭氧作为治疗剂应用于ALS小鼠时，具有选择性的神经保护和可能的抗炎能力以及潜在的治疗能力。

4.2 神经干细胞(neural stem cells, NSCs) 臭氧在体外对NSCs也可产生影响。Costanzo等[28]研究了轻度臭氧化对人脂肪源成体干细胞(human adipose tissue derived adult stem cells,hADAS)的影响，通过组织化学、形态计量学和超微结构分析，表明低浓度臭氧可诱导hADAS细胞中的脂质生成，且不会产生有害影响，为未来阐明轻度臭氧化对脂肪组织的影响以实现组织再生和组织工程的研究铺平了道路。Tricarico等[29]为深入了解臭氧对NSCs的作用机制，测试了臭氧对神经外胚层细胞(神经元前体和分化神经元)的影响，量化它们的增殖、迁移、细胞因子释放和细胞存活，结果发现，臭氧会显著影响细胞因子的释放、细胞迁移的距离并导致细胞增殖的轻微变化，且低浓度臭氧增加细胞迁移的距离，为进一步研究臭氧在神经系统再生中的应用奠定了坚实的基础。

总之，由于臭氧具有安全有效、价格低廉、操作简便、感染等并发症少和适用范围广等优点，近年来臭氧在国内外的研究和应用越来越广，大量的实验室研究提供了臭氧抗炎、抗氧化能力，以及血管、血液和免疫系统调节的证据[30, 31]。已有研究发现，臭氧对神经系统疾病起到治疗作用，但其机制尚未明确，仍需进行更深入地研究，扩大临床应用范围。