循环外泌体微RNA在支气管哮喘中的作用综述

陈仪婷，赵安达，李 荣，康文慧，李生慧

1.上海交通大学公共卫生学院，上海 200025；2.上海交通大学医学院附属第九人民医院营养科，上海 200011

据统计，目前全球约有3 亿人患支气管哮喘（简称哮喘），且患病率正呈指数级增长，预计到2025年，将有1亿的新增哮喘患者［1］。哮喘是一种遗传和环境因素共同作用的异质性疾病，其病理特点复杂，临床表现各异，缺乏灵敏、有效的诊断方法；作为一种慢性疾病，它目前尚无法彻底治愈，只能通过规范用药缓解症状，使病情在一定程度上得到控制［2］。临床上根据哮喘的严重程度来确定用药的剂量和频率，因此准确判断哮喘病情分级是治疗的关键。目前主要根据患者的临床症状和第一秒用力呼气容积（forced expiratory volume in one second，FEV1）进行哮喘的病情分级。然而，据报道20%～73%的哮喘患者被漏诊或病情被低估，延误了治疗［3］。目前尚未有研究证实存在敏感的生物标志物可用来判断哮喘的病情和表型、预测患者的治疗效果及预后。越来越多的证据表明哮喘受到各种外泌体的调节。因此，了解外泌体在哮喘发病机制中的作用，有助于发现特异性的生物标志物用以早期诊断和开发有效的治疗方法，并对哮喘预后作出准确评估［4］。微RNA（microRNA，miRNA）有作为诊断哮喘的生物标志物的潜在价值，但外周循环中的miRNA易受其他成分的干扰，导致以往该领域的研究结果尚不一致［5］。外泌体具有双层膜结构，可抵抗血液中核糖核酸酶的降解，使循环外泌体miRNA 具有高稳定性，是一种理想的生物标志物［5］。既往研究多关注肺部以及气道微环境中的外泌体在哮喘中的作用［6］。在这篇综述中，我们总结了血液中的循环外泌体miRNA作为哮喘诊断、表型鉴别、病情进展和预后疗效判断的生物标志物的最新进展。

1 循环外泌体miRNA

外泌体是直径为30～100 nm 的细胞外微小囊泡，主要由体细胞分泌，分布于血浆、血清、乳汁等体液中；其内容物成分通常由生物分子组成，如脂质、蛋白质、短肽链、DNA 片段、RNA［包括信使RNA（messenger RNA，mRNA）以及miRNA］等［7］。其中，miRNA 是一类内源性短链非编码RNA，长度为19～25 个核糖核苷酸［8］。除细胞中的miRNA 外，血液、尿液等体液中还有以游离形式存在的miRNA，其中在血液中的游离miRNA 被称为循环miRNA［9］。2008 年，循环外泌体miRNA 首次在人体外周血中被发现，其具有高度稳定性，比传统蛋白质组学生物标志物更高效［9］。

外泌体在形成过程中会选择性地装载miRNA 等物质，从而反映分泌细胞的病理生理状况［10］。循环外泌体miRNA 稳定性的前提是外泌体外层的磷脂双分子层结构，该结构能够保护其内容物免受血液中各种酶类物质的影响，确保外泌体在血液循环过程中其内包含的miRNA 在分泌细胞和靶细胞之间实现稳定的、远距离的表观遗传信息传递；这是一种新发现的生物信息传递机制［11］。且miRNA 在转录后调控基因的表达中具有特异性，参与炎症反应、细胞增殖、分化及凋亡等生理过程，调控多种疾病的发展，因此其具有的生物标志物潜力受到广泛的关注。

2 哮喘的病因

随着分子生物学技术的发展，哮喘发病机制的假说也不断得到更新。目前，学者［12］普遍认为哮喘发病和病情进展与多种机制存在关联，主要是气道炎症和气道重塑机制。其中，气道炎症在哮喘发病过程中发挥着重要的调节作用。哮喘的主要病理生理特征表现为辅助性T 细胞2（T helper cell 2，Th2）和2 型固有淋巴细胞（type 2 innate lymphoid cells，ⅠLC2）释放促炎因子［如白细胞介素-4（interleukin-4，ⅠL-4）、ⅠL-5、ⅠL-13 等］，气道嗜酸性粒细胞增多，呼出一氧化氮水平升高。这一炎症反应对气管的持续性损伤导致气管壁结构发生变化（如基底膜增厚、平滑肌细胞肥大或增生、胶原纤维增生、弹性组织破坏、黏膜化等），即出现气道重塑，并伴随着气道高反应性的持续存在。

3 循环外泌体miRNA与哮喘间的联系

目前已有大量研究提示miRNA 在哮喘的诊断、病情严重程度和表型判断、预后预测中起到重要的作用。然而，大部分研究集中于淋巴细胞、支气管上皮细胞和免疫细胞源性外泌体miRNA 在其原代细胞和器官中的调控作用［6］。而循环外泌体miRNA 具有稳定且易于检测的特性，能够被远处的细胞吸收进行信号转导，调节免疫应答和参与相关炎症性疾病的发生发展，成为许多免疫性疾病的关键信号调节分子。目前针对循环外泌体miRNA 与哮喘之间的研究较少，现有的数据结果提示其具有成为诊断、鉴别和反应哮喘治疗效果的生物标志物的潜力。

3.1 哮喘临床诊断

哮喘早期症状轻微，可能无明显症状，若不及时有效控制气道炎症，少部分患者在接触诱因后可出现急性发作，严重时危及生命。此外，即使无急性发作情况，反复的发作也会加重气道重塑，导致肺功能的不可逆损伤。所以，哮喘防治的关键在于是否能够早诊断、早治疗。

目前，人群研究［13-20］的结论均提示：哮喘患者循环外泌体miRNA表达失调，与健康对照存在差异。2015年，ⅠSHMAEL等［13］从38例哮喘患者和29例非哮喘患者的血液中分离出miRNA，首次表明哮喘患者与非哮喘患者中30 种miRNA（21 种增加，9 种减少）存在表达差异，并进一步提出miR-570-3p 和miR-155 可诱导气道上皮细胞产生大量细胞因子，初步提示miRNA 的差异性表达可能通过参与气道炎症反应参与到哮喘的病情发展。一项研究［15］则直接选择将重度哮喘患者（n=30）与健康人群（n=30）的血浆外泌体miRNA 做对比，除发现多种外泌体表达水平的差异外，还证实血浆外泌体miR-125b 的上调与高水平的免疫球蛋白E（immunoglobulin E，ⅠgE）和C 反应蛋白（C-reactive protein，CRP）相关，但没有对miR-125b 具体的信号通路做进一步的探究；该研究结果再次提示miRNA 可作为重度哮喘患者炎症水平的生物标志物。此外，一项在成人哮喘患者（n=35）和健康受试者（n=15）的研究中首次关注了中性粒细胞表型哮喘患者血浆中miRNA 水平［18］；发现具有中性粒细胞表型的患者更容易对皮质类固醇药物产生不良反应，从而增加疾病的严重程度并导致难以控制的哮喘［21］；研究［18］结果提示miRNA-199a-5p仅在中性粒细胞中被诱导，水平较健康对照显著升高，通过Wnt、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mamalian target of rapamycin，mTOR）和Hippo 信号通路参与哮喘的气道重塑过程。综合以上研究，外泌体miRNA 在哮喘患者与健康人群间存在差异性表达，目前研究主要认为其通过参与气道炎症反应参与到哮喘的发展进程中；而在中性粒细胞型哮喘中，外泌体miRNA主要参与哮喘的气道重塑过程。

3.2 哮喘严重程度和表型鉴别

鉴别哮喘患者的严重程度和不同表型，分级、分类治疗哮喘患者，对确保哮喘治疗的延续性、准确性有着重要的作用。目前大部分研究［14，17，19-20，22-25］表明，部分循环外泌体miRNA 表达水平与哮喘的严重程度呈正相关，能鉴别不同严重程度、不同表型的哮喘，具有作为临床上判断哮喘严重程度和表型的无创性诊断生物标志物的潜力。

哮喘的严重程度主要分为轻度、中度、重度持续以及间歇状态。王湘云等［14］的研究在未经治疗的哮喘患者（n=82）和健康对照（n=80）中，发现除了哮喘患者与健康人群血清中外泌体miR-21的表达水平存在差异外，血清外泌体miR-21表达水平还与哮喘严重程度呈正相关（r=0.974，P=0.016 7），对间歇状态、轻度持续、中度持续、重度持续哮喘患者诊断的受试者操作特征曲线（receiver operator characteristic curve，ROC曲线）曲线下面积（area under the curve，AUC）分别为0.657、0.769、0.847、0.916。另一项研究［22］在血清外泌体miR-125b 中发现了类似的结论，其对间歇状态、轻度持续、中度持续和重度持续哮喘患者诊断效果的ROC 曲线的AUC 比前者高，分别为0.777 0、0.857 3、0.911 1 和0.999 5；提示将来的研究可纳入多种miRNA 来对哮喘严重程度进行鉴别，以达到更好的诊断效果。近期的一项研究［17］根据既往的文献积累，选择性地提取了血浆中的miRNA，并发现与健康对照组（n=24）相比，中度哮喘患者（n=22）中miR-223 和miR-21 显著上调，对中度哮喘患者诊断的敏感度分别为83%和76%；但与以往研究结果不一致的是，与中度哮喘患者和对照组相比，重度哮喘患者中miR-21 表达明显下调。导致这一差异的原因可能是由于样本量的不足，从外泌体中提取的miRNA 浓度不够，以及一些环境因素干扰了miRNA的表达。

除了严重程度的判别外，在不同表型中，如过敏性哮喘和非过敏性哮喘成年个体中，miRNA 表达谱也存在差异表达；与健康对照相比，miR-155和miR-146a 在过敏性哮喘患者中表达增加，在非过敏性哮喘患者中表达下降；miR-223 的表达与上述2 个miRNA 相反；而miR-374a、miR-126、miR-145 在上述2 组中的表达，差异无统计学意义［24］。而在另一项针对哮喘儿童的研究［26］中则发现：miR-126 和miR-374a 的表达与肺功能［FEV1 与用力肺活量（forced vital capacity，FVC）之比］呈正相关。上述研究提示年龄水平等生理因素可能影响miRNA 表达与哮喘间的关联。

衰老是影响miRNA 表达的重要因素，HUAN等［27］对全血中150种的miRNA 的分析结果显示，近70%的miRNA 与年龄呈负相关；而目前研究大部分在成人中开展，仅有3 项关于儿童和一项在老年人中的研究。除上述提及的关于哮喘儿童肺功能的研究［26］外，一项在2016年开展的研究［19］将95例哮喘患儿分为3 组，分别为40 例未吸入皮质类固醇的哮喘、40 例类固醇敏感型哮喘和15 例类固醇耐受型哮喘，并将80 例健康儿童作为对照。该研究发现血清miRNA-21 在鉴别类固醇敏感型哮喘和类固醇耐受型哮喘方面具有预测价值（AUC 为0.99，特异度86.7%，敏感度97.5%）。针对急性期发作的儿童哮喘患者，研究［20］进一步在哮喘住院患儿（48例）和其他疾病住院患儿（48 例）中展开，其结果表明血清外泌体中miR-7b 的表达可用于鉴别急性发作期和临床缓解期的儿童哮喘（AUC 为0.801，特异度72.9%，敏感度74.5%）。一项研究同时纳入了老年和非老年人群，并对分别对2 个年龄段人群中的哮喘和非哮喘患者miRNA 的表达进行对比［25］；尽管在所有研究对象中，哮喘患者的气道炎症水平都高于健康对照组，但miRNA-106a 和miRNA-126a 的表达仅与非老年人群的哮喘控制呈负相关，在老年人群中没有发现该相关性，再一次提示年龄等生理因素可能影响miRNA的表达，从而影响其对哮喘表型的鉴别效果。未来需要更多针对不同年龄、不同身体健康状况人群的研究来进一步证实这一观点。

综合已有研究可知，部分特定的循环外泌体miRNA 浓度可能与哮喘病情的严重程度呈正相关，且miRNA 浓度在哮喘病情稳定时也保持同步稳态。此外，循环外泌体miRNA 还具有鉴别过敏性哮喘和非过敏性哮喘等不同哮喘表型的潜力。但是由于目前该领域研究数量较少，已有研究中大部分的样本量较少，外泌体提取方案的不同等原因，导致研究结论尚不统一。未来需要更大样本量的前瞻性研究，并开发更加成熟有效的技术高效地提取miRNA，针对不同哮喘表型和严重程度，考虑不同年龄人群的特点，进一步确定循环外泌体miRNA 质与量的变化规律，提供有价值的研究成果以指导临床应用。

3.3 哮喘药物治疗效果和预后评估

RⅠAL 等［28］的研究中纳入了16 例嗜酸粒细胞性哮喘患者，分为瑞利珠单抗治疗组（10 例）和美泊利单抗治疗组（6 例）进行为期8 周的治疗，发现患者血清中的miRNA 在治疗后表达水平发生改变，其中miRNA-338-3p 表达水平升高最为显著，但是在不同治疗组间没有差异。在对健康受试者外周血单核细胞体外试验中，研究者［13］发现糖皮质激素可抑制miR-155、miR-374a、miR-570-3p 的产生。而另一项研究［24］结合了临床数据和生物信息学分析手段，发现当哮喘患者吸入糖皮质激素后，在过敏性哮喘患者血清中观察到miR-155、miR-146a、miR-374a和miR-145 的表达增加；在非过敏性哮喘患者血清中miR-223 和miR-374a 的表达与血液嗜酸粒细胞的水平相关，与是否吸入糖皮质激素无关。队列研究［23］在基线调查后的6～12 个月对20 例哮喘患者进行随访，其结果则提示在治疗措施没有改变、自身病情保持稳定时，miRNA 的表达在一段时间内保持稳定。哮喘药物治疗是否可导致血液中循环miRNA 表达的改变，以及这一变化的幅度，可能受患者自身健康状况和疾病表型等的影响。但目前该领域研究较少，证据尚不充分，需要未来更多的研究来扩充和证实。

3.4 潜在生物学机制

根据大部分已有研究结果显示，miRNA 的表达差异参与调节气道炎症过程，维持上皮细胞稳态和气道重塑［29］；并且与肺功能呈负相关［16，18，24］，与炎症指标如嗜酸性粒细胞［16，19］、中性粒细胞［16］、血清ⅠgE 和CRP［15］、促炎细胞因子［20］、ⅠL-4［20］呈正相关。

miRNA 参与了T 淋巴细胞和气道结构细胞（如气道平滑肌细胞、气道上皮细胞）之间的通信，T 细胞的激活诱导miRNA 的产生和分泌，这些miRNA 被气道结构细胞吸收导致嗜酸性粒细胞增多和肺部炎症［30］。循环外泌体miRNA 还调控哮喘的重要信号通路［28］。例如，miR-223 靶向胰岛素样生长因子-1 受体（insulin-like growth factor-1 receptor，ⅠGF-1R）、Ras/丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK） 和 磷 脂 酰 肌 醇 3 激 酶（phosphoinositide 3-kinase， PⅠ3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB/Akt）信号通路，促进肥大细胞凋亡［31］。miR-125b 可以抑制p53 的表达，而p53是参与细胞增殖的关键调节因子，也参与线粒体生物合成［32-33］。p53通过激活p21和Bax的转录（其中p21能阻断细胞周期，Bax 诱导细胞凋亡），抑制气道上皮细胞增殖并促使其凋亡［34］。miR-21 被认为是在哮喘的动物体内和人体气道平滑肌细胞中上调幅度最为显著的miRNA，在哮喘气道炎症和气道重塑中发挥了重要作用［35］。miR-21 在MAPK 和B 淋巴细胞受体信号通路中抑制PTEN基因（phosphates and tensin homologue deleted on chromosome ten gene，PTENgene）表达并增加Akt 活性，激活mTOR 信号通路的靶点并产生ⅠgE［36］。此外，miR-21 通过靶向ⅠL-12 的p35基因调节Th2 和Th1 的平衡，影响ⅠL-12/γ 干扰素（interferon-γ，ⅠNF-γ）促炎通路，或通过抑制Toll 样受体2（toll-like receptor 2，TLR2）信号通路调节肺部炎症反应［35］。另外，miR-21 可通过PTEN 通路，激活PⅠ3K/Akt 信号级联反应，诱导细胞增殖和迁移，在哮喘气道重塑中发挥重要作用［37］。因此，在哮喘的发病机制中，miR-21 的功能与抗炎、类固醇不敏感和气道重塑相关。类固醇是一类有效的抗炎药物，参与转录因子调节过程，如诱导核转录因子-κB（nuclear factor-kappa B， NF- κB） 和激活蛋白1（activator protein 1，AP-1）［38］。而miR-21 受NF-κB和AP-1 的调控，两者通过与miRNA 启动子结合激活miRNA 转录并增强其表达，可部分解释miRNA 在不同类固醇耐受型哮喘患者中的表达差异［39-40］。但其中机制尚未完全阐明，还可能受到年龄、自身健康状况等因素的影响［24，27］。

4 总结与展望

在哮喘的临床诊断、病情严重程度和表型判断、疗效和预后评估领域，对特异性循环外泌体miRNA表达的差异和变化的探究是一个新颖且具有前景的方向。然而，由于外泌体研究的临床起步较晚，目前仍然面临着许多问题与挑战。基于上述论述，可以总结出以下2 点：①既往研究中差异化表达的miRNA 种类尚不一致，主要涉及miR-21［14，17，19］和miR-125［15，22］。多种循环外泌体miRNA 可能协调作用于哮喘发生与发展，且一些与哮喘相关的miRNA 似乎具有相同的功能，但各研究结果不一致，无法得出统一结论。②目前报道的大部分研究样本量较小，且绝大部分在成人中进行，没有考虑到特殊人群不同的生理特征差异。另外，虽然不少研究对循环外泌体miRNA 在哮喘病理机制中的作用进行了初步研究，但miRNA 的组织或细胞来源、运输方式与途径、以及靶细胞尚不清楚。循环外泌体miRNA 的靶向特异性较差，这可能导致miRNA 在实际治疗过程中出现脱靶等情况。并且缺乏统一的提取方案，提取出的循环外泌体miRNA 含量少，检测难度大、成本高。

目前，该领域仅有的相关基础研究，提示循环外泌体miRNA 在哮喘疾病的诊断、病情严重程度和表型鉴别以及治疗效果的评估等方面都可能发挥着重要的作用，但将研究结果转化应用于临床仍有较大的距离。希望未来研究的不断深入与发展，为哮喘的诊断和表型鉴别提供安全、便利、灵敏的早期生物标志物，为哮喘治疗以及预后评估提供可靠、可行的靶向性策略。