近视相关非编码RNA的研究进展

陈威存，苑 影，柯碧莲

上海交通大学医学院附属第一人民医院眼科，上海 200080

在人类基因组中，非编码RNA （non-coding RNA，ncRNA） 是一类不具有蛋白质编码功能的RNA，主要包括微RNA（microRNA，miRNA）、长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）、环状RNA（circular RNA，circRNA），可参与机体的生长发育、免疫反应、肿瘤形成等多种病理生理过程。研究发现，非编码RNA 能在多个生物水平调控基因表达、细胞分化、细胞增殖、感染及免疫应答。其中， miRNA 能够与信使RNA （message RNA，mRNA）结合并诱导其沉默降解，进而限制基因转录之后的表达。lncRNA 组织特异性高，属一类多功能调节分子，虽然lncRNA相较于miRNA序列保守性较低，但具有不同层面的调节功能。lncRNA 调控主要分为4 个层次：①表观遗传学修饰。lncRNA 能够改变DNA/RNA 甲基化状态、染色体结构从而控制基因表达。②转录调控。lncRNA 能与转录因子结合从而控制基因转录活性。③参与mRNA 转录后调控过程。例如RNA 编辑、蛋白翻译、可变剪切。④控制miRNA 从而影响mRNA 表达。lncRNA 亦可与mRNA竞争性结合miRNA（海绵作用），阻止miRNA 与靶基因结合［1］。circRNA 除了高度组织特异性以外，由于共价环结构维持其高稳定性，是一类具有生物医学潜力的非编码RNA［2］。

近视是一种眼球过度发育性疾病，当眼轴延长时，远处的平行光线无法聚焦于视网膜上，导致患者视远不清。我国是近视大国，近视的发病率过去20年间上升了约20%，且近年来呈现高度化趋势，我国将面临严重的公共卫生挑战［3］。SUN 等［4］发现，大学生近视患病率为95.5%，其中高度近视占19.5%。东亚、东南亚地区近视患病情况尤为严重，据调查［5］，青壮年近视人数占80%～90%，高度近视的患病率则高达10%～20%。一项全球性的报道［6］中预测，全球近视人口在2050 年将达到总人口数一半，其中10%为高度近视人群。而高度近视容易伴发可威胁视觉功能的并发症［7］，如视网膜脱离、青光眼、黄斑脉络膜变性等［8］。目前，临床上对于近视的矫正多采用配戴眼镜或屈光手术等对症治疗的方法，对于近视病因的研究是临床亟待解决的难点和重点问题［9］。近视发病的经典研究认为，近视过程中，视觉信号作用于视网膜色素上皮细胞或视网膜细胞，刺激并释放一些细胞因子［10］，进而传导至巩膜组织，导致细胞外基质重塑、胶原降解及巩膜变薄，最终导致眼球延长，近视发生发展［11］。大多数学者认为，近视是环境因素和遗传因素互相作用的一类疾病。因此探究近视基因的表达、修饰以及各种RNA 系统的改变显得尤为重要［12］。

近年非编码RNA 在近视研究中受到越来越多学者们的关注。基于测序技术及生物信息学的快速发展，与近视相关的复杂调控及代谢通路的研究得到了长足的发展。因此，本篇综述总结了与近视相关的非编码RNA 研究进展，及其在近视发病机制中的潜在作用，以期提供更多防控近视的干预靶点和思路。

1 miRNA与近视

miRNA 是一类长度约22 个核苷酸的单链非编码RNA，大部分具有高度保守性。成熟的miRNA 识别并结合靶向mRNA 非编码区（3'-UTR），促进目标mRNA 降解或抑制mRNA 翻译，从而调控基因表达［13-15］。大量研究证实miRNA 广泛参与细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、细胞代谢等各种细胞生物学活动［16］。近年来，研究发现miRNA 与近视密切相关，基于miRNA 表达谱与基因表达调控的相关研究，可能为延缓近视进展提供一条重要线索。下文以视网膜和巩膜为靶组织描述近视发生发展的分子生物学机制。

1.1 miRNA调控近视巩膜重塑的作用

METLAPALLY 等［17］首次应用miRNA 表达谱技术分析巩膜的发育情况。通过比较成人与胎儿（24周）巩膜组织的miRNA，探索差异表达的miRNA 与胶原调节、细胞外基质重塑之间的关联，从而寻找影响眼球生长发育的 miRNA。 定量反转录 PCR（quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR）结果证实，胎儿巩膜周边部与后级部组织中miR-214、let-7e、miR-103、miR-107、miR-98 表达显著上调，而let-7b 和let-7c 仅在成人和胎儿后极部表达有差异。根据胎儿巩膜处于快速成长期，可能与近视发展时巩膜生长的过程类似，因此推测胎儿巩膜差异表达发现的miRNA 可能与近视时胶原蛋白代谢、巩膜重塑密切相关。

为了探索miRNA对近视巩膜重塑的作用及机制，TANAKA 等［18］应用负透镜诱导的近视（lens induced myopia，LⅠM） 小鼠模型，对巩膜进行miRNA 微阵列分析发现：与对照组相比，近视小鼠巩膜检测出大量差异表达miRNA，其中30 个miRNA上调，40 个miRNA 下调。此外，与眼内其他组织间差异表达miRNA 关联性分析发现：mmu-miR-7047-3p、mmu-miR-7085-3p 和mmu-miR-96-5p 在眼前节及后节组织样本中显著高表达。GUO 等［19］为了深入研究巩膜重塑在近视发展过程中的机制，对LⅠM的豚鼠巩膜组织进行高通量测序分析，鉴定出27 个差异表达miRNA，这些miRNA 与过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferators-activated receptor，PPAR）信号、丙酮酸和丙酸乙酯代谢以及转化生长因子-β （transforming growth factor-β，TGF-β）等信号通路有密切关联。研究［19］表明，上调的rno-miR-19b-3p 可能是过氧化物酶体增殖物激活受体α （peroxisome proliferators-activated receptor-α，PPAR-α）潜在的直接调节器，而PPAR-α 已被证实在LⅠM 豚鼠巩膜组织表达下调。针对巩膜组织在不同近视动物模型的高通量分析，获得许多可能在近视发展过程中起调节作用的miRNA 及可能的代谢通路，但其具体机制仍待确认。

1.2 近视视网膜miRNA 的表达及其调控机制

METLAPALLY 等［20］对形觉剥夺性近视（form deprived myopia， FDM）小鼠进行miRNA 与mRNA差异表达分析发现，54 个miRNA 和261 个mRNA 呈现差异表达。后续实验证实在FDM 小鼠模型中let-7a显著下调，miR-16-2 显著上调。此外，3 个候选mRNA 靶基因Smok4a、Prph2和Gnat1可作用于近视时巩膜细胞的调控。TKATCHENKO 等［21］研究FDM 10 d 的小鼠视网膜miRNA 表达谱，共发现53 个差异表达miRNA，其中37 个上调，16 个下调。经过ⅠPA基因交互网络软件分析，发现其中9个mRNA 与神经形成的相关信号通路有所重叠。MEⅠ等［22］收集FDM 34 d 小鼠模型的眼组织，以微阵列的数据结果分析发现，视网膜组织中获得24个差异表达miRNA，其中2 个miRNA（miR-466h-5p 与miR-466j）富集于突触传递的相关生物过程中，如轴突引导和TGF-β信号通路。LⅠU 等［23］通过FDM 近视小鼠的miRNA表达谱分析进行全面的生物信息学分析，以寻找近视相关miRNA；该研究将GSE58124 和GSE84220 这2 个原始微阵列数据集信息进行合并，观察到mmumiR-1936、mmu-miR-338-5p 和mmu-miR-673-3p 3 个与近视显著相关的上调miRNA，靶基因主要为富集在视网膜组织的发育和泛素化结合相关的基因。此外， 前2 个miRNA 在定量聚合酶链反应（quantitative PCR，qPCR）实验验证也观察到差异具有统计学意义。因此，根据结果可知，mmu-miR-1936、mmu-miR-338-5p 和mmu-miR-673-3p 上调可能与近视发展过程中的调控有关。根据不同动物近视模型视网膜组织的miRNA 研究分析，确定了对照组与近视组表达差异的miRNA，提供更多近视潜在的生物标志物。可见，视网膜组织细胞中也包括许多调节近视的差异表达miRNA，但需等待更进一步的功能试验验证与近视发展机制的关系。

1.3 miRNA与相应靶基因调节近视发展

miR-29a 具有调节细胞外基质的功能，被认为是治疗近视的一个潜在靶标。研究证实，miR-29a 与Ⅰ型胶原蛋白α1 链（collagen type Ⅰα1，COL1A1）和基质金属蛋白酶2 （matrix metallopeptidase 2，MMP2）的表达密切相关。近视模型研究证实，巩膜组织中COL1A1表达减少，MMP2表达增加［24-26］。XⅠE 等［27］研究发现，miR-29a 可靶向COL1A1基因，使位于单核苷酸位点rs157907 的G 等位基因产生突变，从而降低近视风险。ZHANG 等［28］过表达RPE细胞和人类巩膜成纤维细胞的miR-29a 发现，近视相关基因MMP2表达受到抑制。WANG 等［29］证明京尼平药物能够抑制豚鼠近视模型miR-29 簇和MMP2基因，促进COL1A1在巩膜组织的表达，可作为近视的一种干预策略。ZHU 等［30］的研究结果显示近视组miR-29a 表达水平显著高于对照组；该团队以高通量测序的方法鉴定高度近视患者房水的miRNA表达谱，研究提取高度近视患者与对照组白内障患者的房水进行比对，找出262 个miRNA 表达上调，5 个表达下调，其中包括17 个新发现的miRNA，通过qPCR 验证高度近视患者的hsa-let-7i-5p、hsa-miR-127-3p 和hsa-miR-98-5p 的表达具有潜在意义。进一步分析研究［31］发现，miR-29a 在高度近视患者的房水和血浆有更高的表达水平。调控机制方面，miR-29a 能够抑制人成纤维细胞的Ⅰ型胶原蛋白合成，可作为调节近视发育的生物标志物进行进一步研究。此外，miR-29a 除了在近视模型中调控细胞外基质，也可在近视患者房水靶组织中起调控作用。

研究表明，miR-328 与近视相关基因PAX6（paired box 6）、MMP2、HOXA9（homeobox A9）有关联［26，32-34］。CHEN 等［35］证实，miR-328 与PAX6基因在人类RPE 细胞和巩膜成纤维细胞都有显著表达。LⅠANG 等［36］研究表明PAX6的单核苷酸位点rs662702 可能与miR-328 结合调节近视发展。当miR-328 结合rs662702 的C 等位基因，会负向调节靶基因PAX6，并增加MMP2的表达。同时，视黄酸会根据剂量依赖性地增加miRNA-328 的表达，进而抑制PAX6的表达。根据先前文献报道［37-38］，视黄酸反应组件位于miRNA-328 启动子中，可能在FDM 模型的代谢变化中发挥作用。KUNCEVⅠCⅠENE 等［39］检测近视患者外周血样本发现，miR-328 表达显著上调，但是miR-328与PAX6基因（rs662702）多态性之间的关联未被证实。LⅠANG等［40］研究发现上调人类及小鼠原代RPE 细胞miR-328 水平，HOXA9表达亦增加，PAX6基因水平则被抑制。KUNCEVⅠCⅠENE 等［41］通过外周血样本以及眼底照相分析RPE 细胞的光密度与miR-328 和PAX6基因（rs662702）多态性的关系。结果表明，近视患者会随着血液中miR-328 的上升，RPE细胞的光密度显著减低，但是rs662702单核苷酸基因型变体与RPE 细胞的光密度无显著关联。miR-328 的调控机制可以解释近视者和健康者之间，各个组织细胞分子不同的调节作用。

2 lncRNA与近视

lncRNA 是大于200 个核苷酸的非编码转录物质，一般存在于细胞核和细胞质内，多数不具备编码翻译功能，但少量lncRNA 能编码小蛋白参与生物过程［42］。根据基因组上的特定位置可将lncRNA 分为5 种类别，分别是反义、有义、双向、内含子和基因间RNA［43］。许多研究证实lncRNA 是控制细胞分化、细胞周期、基因组完整性的关键分子［44］。lncRNA 在眼肿瘤、青光眼、白内障、视网膜等眼部疾病均有研究报道［45］。近年来，lncRNA 调控近视的作用受到学者的关注。GENG 等［46］对FDM 和LⅠM 的豚鼠视网膜、脉络膜及巩膜样本，采用高通量RNA 测序分析，结果显示：FDM 组有228 个lncRNA 上调，144 个lncRNA 下调；LⅠM 组则有119 个lncRNA 上调和128 个lncRNA 下调。这些差异表达的lncRNA 中，只有68 个在2 种近视模型中呈现出共同的趋势。经与qPCR 验证lncRNA 表达，相比于对照组，FDM 组和LⅠM 组lnc000906 和lnc000049 这2 个lncRNA 的表达皆上调；相反地，lnc0031538 和lnc002905 的表达则下调。此外，2 组近视模型（FDM 组vsLⅠM 组）之间的lnc0031538和rna39119表达有差异。进一步采用基因功能聚类分析发现，异常表达的lncRNA 可调节细胞外基质成分，并参与激酶活性、新陈代谢等生物学过程，也可能参与调控细胞外基质的糖胺聚糖降解和黏蛋白型O-聚糖生物合成的过程。因此，lncRNA可能通过参与细胞外基质成分调控信号通路控制近视的发生，但其具体机制仍不明确。

3 circRNA与近视

circRNA 是一种具共价闭环结构的RNA，通过mRNA 反向剪接下游5′端位点与上游3′端位点连接所形成的单链闭环，因此不具备5′端至3′端极性和3′端聚腺苷酸化末端。circRNA 与线性RNA 相比表达水平更加稳定，具备更好的稳定性和保守性［47-48］。由于其高度稳定性和组织特异性，有望应用于疾病治疗［49］。生物学功能方面，circRNA 具有类似于lncRNA 的miRNA 海绵效应，可通过竞争性结合内源性RNA，影响miRNA 介导的后续调节机制［50］。作为新型的非编码RNA， circRNA 在近视中的作用备受关注。近视发展过程中，脉络膜厚度变薄，脉络膜血流减少，这可能是导致巩膜缺氧重塑的原因［51-52］。LⅠ等［53］在FDM 模型中，观察到circRNA-FoxO1 的水平在脉络膜组织中显著上调。为了明确circRNAFoxO1对于脉络膜的作用，进一步通过体外细胞实验证实，抑制circRNA-FoxO1可降低脉络膜内皮细胞的增殖、迁移和血管形成能力。体内实验研究发现，沉默circRNA-FoxO1能够减缓豚鼠眼轴延长和玻璃体长度增加。此外，circRNA-FoxO1 过表达可抑制miR-145，并诱导VEGFA 和ANGPT2 水平升高。荧光素酶实验证实，VEGFA/ANGPT2是miR-145 的目标基因。因此，该研究证实并总结circFoxO1-miR-145-VEGFA/ANGPT2 通路参与调节脉络膜血管功能，调控近视的发展。

4 结语与展望

随着与近视相关的非编码RNA 研究的深入，我们对于近视的机制研究有了全新的认识，其中miR-328、miR-29a、circRNA-FoxO1 都是与近视相关的重要分子。本文全面总结从近视患者与动物近视模型筛选出的miRNA、lncRNA 及circRNA，试图阐明非编码RNA 与近视的潜在关联。miRNA 作为非编码RNA家族的重要一员，描述大量miRNA与近视研究相关，但是调节机制作用待后续实验验证；目前已知由miR-328 介导的PAX6基因下调与高度近视相关联，在近视形成过程发挥重要调控作用；miR-29a 在细胞外基质中具有分子调控功能，作用于MMP2和COL1A1基因，影响巩膜成纤维细胞的表达；circRNA 可以通过与miRNA 相互作用以调控后续信号通路。circRNA-FoxO1 在脉络膜血管血流方面具有重要作用，受到抑制时血流增加，缓解眼轴生长的速度；其过表达时则可抑制miR-145 的表达，增加近视发生的机会。然而其他circRNA 与近视相关的研究结果甚少。lncRNA 和circRNA 在近视领域都处于起步的阶段，不管是近视模型或病例组织样本的高通量筛选，或是非编码小分子于疾病的功能调节，现今仍有许多近视相关分子能够被挖掘或应用。

目前，因为近视患者的视网膜、巩膜临床样本难以获得，仅有少部分文献观察近视患者的房水中细胞因子水平的变化，非编码RNA 分子研究调控机制探索和临床治疗干预试验更是少数。因此，未来如果可能有更多的靶器官样本的研究，或结合近视的基因学和外周血的研究，探索非编码RNA 于巩膜重塑过程或脉络膜血管血流的调控，将有助于从近视人群中寻找重要的分子机制，为近视的干预治疗提供全新的思路。