评价MALDI-TOF MS 在快速鉴定腹膜透析相关腹膜炎病原菌的价值

吴清念，刘春林，黄德兵

（佛山市南海区人民医院检验科，广东 佛山528200）

腹膜透析是治疗终末期肾病的有效手段之一[1]。 腹膜炎是腹膜透析患者常见的并发症，严重的腹膜炎或多次腹膜炎发作是导致患者退出腹膜透析的主要原因，治疗不及时，一方面会导致腹膜超滤能力下降加剧病情；另一方面，造成医疗费用增加，死亡率可高达20%[2-3]。 明确腹膜炎感染病原菌有助于临床进行针对性治疗， 但现有基于培养的传统检测方法，通常耗时18~48 h，并不能及时满足临床的需要。 近年来，基质辅助激光解离电离飞行时间质谱 （Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight，MALDI-TOF MS，简称MS）在临床微生物的鉴定应用得到广泛关注，具有快速、经济、准确等优点[4-5]。因而，本研究拟评价MALDITOF MS 在快速鉴定腹膜透析相关腹膜炎病原菌的价值，以期为临床提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 样本来源 收集2018 年1 月至12 月在本院住院临床诊断腹膜透析相关腹膜炎患者125 例，将腹膜透析液培养阳性45 例作为样本来源。

1.2 传统鉴定方法 腹膜透析液检测采用美国BD9120 全自动血培养系统，细菌分离及鉴定依据全国临床检验操作规程第三版。 取腹膜透析液培养阳性瓶并从中吸取培养液涂片， 干燥后固定并进行革兰染色； 同时接种固体培养基包括哥伦比亚血琼脂平板、麦康凯平板和巧克力平板（均购自江门市凯林贸易有限公司）。 菌株的鉴定采用梅里埃VITEK 2 Compact 细菌鉴定药敏仪。

1.3 MALDI-TOF MS 方法

1.3.1 标本前处理 采用差速离心联合分离胶促凝管富集法：第一步，用5 mL 注射器从阳性瓶中抽取5 mL 培养液至无菌洁净的试管中，1 000 r/min离心10 min（将大部分红细胞、白细胞及大分子杂质分离至底部），用加样枪吸取上清液转移至分离胶促凝管。 第二步，将上清液3 500 r/min 离心15 min，弃去上清液，加70%乙醇反复吹打沉淀物，然后1 000 r/min 离心10 min， 用加样枪吸取上清液转移至1 mL Ep 管，13 000 r/min 离心2 min，弃去上清液。第三步，向EP 管中加入生理盐水900 μL，充分混匀悬液1 min，离心菌体细胞13 000 r/min，2 min（洗去乙醇避免影响图谱质量），留下沉淀物备用。

1.3.2 标本检测 将50 μL 70%甲酸水溶液加入沉淀物中，通过移液枪反复吹打，然后进行漩涡充分混匀。 进一步加入50 μL 乙腈，通过移液枪反复吹打混合悬液。 13 000 r/min，2 min 离心微生物提取物。 将1 μL 微生物提取物上清液吸取到MALDI靶板上，室温晾干。 加入1 μL HCCA 基质液覆盖在样本上，室温晾干。 将MALDI 靶板放入质谱仪检测。 以上严格按照质谱操作流程进行。

1.3.3 试剂耗材 MALDI-TOF MS 仪及其配套试剂乙腈、 甲酸、HCCA 基质液、96 孔不锈钢靶板均购自德国Bruker 公司； 血清分离促凝胶管购自广州科普医疗生物技术有限公司。 质控菌株包括大肠 埃 希 菌 （ATCC25922）、 金 黄 色 葡 萄 球 菌（ATCC25923）均购自广东省临床检验中心。

1.3.4 统计分析 所有数据在EXCEL 2003 软件包处理，与传统方法为对照，计算MS 质谱仪鉴定的一致率和准确度。

2 结果

在本次研究中， 共有125 例腹膜透析相关腹膜炎患者， 腹膜透析液培养阳性45 例， 检出率36%。 其中送检腹透液培养523 瓶，阳性报警瓶为112 瓶。 单一感染42 例占93.3%，混合感染3 例占6.7%（大肠埃希菌+表皮葡萄球菌、 金黄色葡萄球菌+粪肠球菌、铜绿假单胞菌+表皮葡萄球菌）。 以传统鉴定方法为参照， 传统鉴定方法与MALDITOF MS 法总体一致性为80%，其中对革兰阴性菌一致性较高为86.9%，革兰阳性菌为70.6，见表1。

3 讨论

本研究首次报道了，MALDI-TOF MS 在快速鉴定腹膜透析相关腹膜炎患者腹透液病原菌的价值，结果提示，传统鉴定方法与MALDI-TOF MS 法总体一致性为80%， 其中对革兰阴性菌一致性较高为86.9%，革兰阳性菌为70.6，展示了较好的鉴定能力。

MALDI-TOF MS 是一种检测微生物的新型工具，具有快速、准确、经济等优势[4-5]。 大量的文献报道[6-8]，MS 能够对单个细菌菌落快速鉴定，MS 数据库能够覆盖常见的细菌、 真菌以及分枝杆菌。 MS还可以直接检测临床样本比如血液、 尿液、 腹水等。 与直接鉴定单个菌落的不同，直接检测样本，其前处理方法与正确鉴定率有很大的关系。 目前，MS 直接检测血培养阳性病原菌比较成熟，提取细菌蛋白方法有Sepsityper 试剂盒、 分离胶促凝管、滤 膜 吸 附 法 等[9]。 Wüppenhorst 等 报 道[10]，应 用Sepsityper 试剂盒，MS 对500 个需氧和厌氧阳性瓶检测，正确鉴定率89.5%。 另一篇报道[11]，比较不同富集法联合MS 检测中段尿病原菌的价值，分离胶促凝管离心和差速离心富集联合MS 检测，总体鉴定一致性分别为86.7%和81.9%。 最近丁秀荣等报道[12]，采用差速离心法评价MS 对196 阳性瓶为单株感染腹水，菌株的种鉴定符合率为77.6%，其中革兰阴性菌的种75.9%，革兰阳性菌的种鉴定符合率为80.2%，但他们对6 瓶混合菌感染样本，均鉴定出其中一种菌。 与上述研究稍有不同，本研究采用差速离心联合分离胶促凝管富集法对腹透液阳性瓶直接检测， 结果提示总体细菌鉴定一致性达80%，对革兰阴性杆菌鉴定率较高达86.9%。 尤其值得注意的是， 本研究中3 个混合感染样本，MS准确地鉴定出2 个混合细菌感染样本， 作者主要是基于阳性培养液革兰染色涂片结果， 同时采用MS 混合菌库模式手工分析图谱峰，都得到了较满意的结果。 与本研究样本处理方法不同，芦嘉报道[13]，采用腹水短期培养后再进行MS 检测，单一细菌生长的样本鉴定结果与常规方法符合率达到94.1%，高于本研究（符合率80%），究基原因可能是病原谱构成不同，以及标本类型不一样（腹透液VS 腹水）， 细胞和蛋白含量都可能影响细菌蛋白的提纯。 此外，有学者报道，同一份样本多孔涂布在靶板上， 增加检测次数有助于提高鉴定的准确性， 这可以尝试地运用在鉴定结果不理想的样本中[14]。

总之， 本研究采用差速离心联合分离胶促凝管富集法对腹透液阳性瓶直接检测， 得到较高的准确性，能够为临床提供病原学证据，助于临床早期使用抗生素改善患者的预后。