PD-1/PD-L1通路在自身免疫性眼病中作用的研究进展

杨辰玲，周慧芳

上海交通大学医学院附属第九人民医院眼科，上海市眼眶病眼肿瘤重点实验室，上海 200011

自身免疫性眼病是一组机体对自身抗原产生免疫反应而导致眼表、眼内及眼眶周围组织受到损害的疾病，主要包括自身免疫性葡萄膜炎（autoimmune uveitis）、 甲状腺相关眼病（thyroid-associated ophthalmopathy）、干燥综合征（Sjögren's syndrome）、视神经脊髓炎谱系障碍（neuromyelitis optica spectrum disorder）、免疫性角膜炎等。它们的发病机制虽不尽相同，但均体现为机体免疫耐受的破坏和免疫稳态的失衡。在自身免疫反应中，T 细胞起到重要作用。虽然人体的中枢耐受机制消除了大多数自身反应性T细胞，但仍有小部分针对自身抗原的特异性T细胞逃逸到外周环境中［1］。机体为了抑制自身免疫的发生，多种调节机制参与其中，包括克隆无能、克隆缺失以及调节性T细胞的抑制作用［2］。

在特异性细胞免疫中，T 细胞激活需要双信号［3］。第一信号由抗原肽/主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex，MHC） 与T 细胞受体（T cell receptor，TCR）的相互作用形成，赋予T 细胞免疫应答特异性，同时也进行抗原识别。第二信号是独立于抗原的“共刺激信号”，通过抗原提呈细胞上表达的共刺激分子与T细胞上的相应受体结合进行传递［4］。已知的共刺激分子包括CD28、细胞毒性T 淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyteassociated antigen-4，CTLA-4）、诱导性共刺激分子（inducible costimulator，ICOS）、程序性死亡蛋白-1（programmed death 1，PD-1）等［5］。共刺激信号不仅可以提供促进T细胞活化的第二信号，还能够提供抑制T 细胞应答的信号，直接或间接地介导T 细胞耐受，从而防止自身免疫反应的发生［6］。其中，PD-1及其配体程序性死亡蛋白配体1（programmed death ligand 1，PD-L1）作为负调控共刺激分子，在参与免疫调节、调控T细胞免疫应答和自身免疫性疾病的发生发展中起了重要作用。2002 年，中国陈列平教授指出大多数肿瘤细胞通过PD-1通路实现免疫逃逸［7］。自此，研究者开始重视该领域并研究相关肿瘤治疗药物［8］。近年来的研究［9］表明，PD-1/PD-L1 通路的失活导致多种自身免疫性疾病的发生，包括系统性红斑狼疮、1 型糖尿病、多发性硬化等。2005 年，干燥综合征的研究发现PD-1 与其具有相关性［10］；此后，在其他自身免疫性眼病中也有类似发现。本文将对PD-1/PD-L1 通路及其在自身免疫性眼病中的研究进展作一综述。

1 PD-1/PD-L1/2信号的生物学效应

1.1 PD-1及其配体PD-L1/2

PD-1即CD279，是一种由288个氨基酸组成的Ⅰ型跨膜蛋白，为CD28 家族成员，相对分子质量为55 000；由胞内胞外两部分组成，胞外段为一个IgV样结构域，胞内段存在免疫受体酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM） 以及免疫受体酪氨酸转换基序（immunoreceptor tyrosine-based switch motif，ITSM）。PD-1 可以在T 细胞、B 细胞、自然杀伤性T 细胞、活化的单核细胞和树突状细胞（dendritic cell，DC）上表达。PD-1 在静止的T 细胞上不表达，但在激活后可诱导表达［11］。

PD-L1（又称B7-H1 或CD274）和PD-L2（又称B7-DC 或CD273）作为PD-1 的2 种配体，同为B7 家族成员，均为典型的由免疫球蛋白恒定区和可变区组成的Ⅰ型跨膜糖蛋白结构［12］。PD-L1 在多种细胞中广泛表达。在免疫细胞中，B 细胞、DC、巨噬细胞、骨髓衍生的肥大细胞和T 细胞上均普遍存在PD-L1的表达，并可在细胞被激活后进一步上调。同时，PDL1 也可以在多种非免疫细胞中表达，包括血管内皮细胞、成纤维细胞、视网膜色素上皮细胞等，这些细胞均可成为自身免疫性眼病的靶细胞。与PD-L1 相比，PD-L2 仅在较少的细胞类型中表达，如活化的DC、巨噬细胞、骨髓来源的肥大细胞和记忆性B 细胞，且表达水平较低［6］。

PD-L1和PD-L2对PD-1的亲和力不同，PD-L2对PD-1 的亲和力为PD-L1 的3 倍。由于结合位点重叠，已有研究［13］为B7/CD28 家族的免疫调节功能增加了新的调节途径，即B7-1 和PD-L1 之间可以结合产生双向抑制作用，能够抑制T细胞的活化和细胞因子的产生。

1.2 PD-1信号通路的生物学效应和免疫调节机制

PD-1/PD-L1通路可以调节免疫能力，有效维持T细胞活化，实现免疫耐受和组织损伤之间的平衡，预防自身免疫反应和慢性感染的发生［6］。但是，该通路也可以被肿瘤细胞利用，肿瘤细胞上的PD-L1 与T细胞表面的PD-1 结合后，可以抑制T 细胞激活和增殖，诱导T细胞的凋亡，使肿瘤可以逃避机体的免疫攻击，在机体内存活、增殖［14］。

T 细胞功能的发挥依赖于细胞因子的产生，PD-1表达水平的改变可以通过共刺激途径调控T 细胞功能。PD-1 低表达会抑制γ 干扰素（interferon-γ，IFN-γ）的产生，同时降低细胞毒性；PD-1极低表达则会抑制肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白细胞介素2（interleukin 2，IL-2） 的产生，同时抑制T 细胞增殖。此外，PD-L1 也可影响T 细胞功能。FRANCISCO 等［15］提出PD-L1可以诱导初始CD4+T 细胞转化为诱导型调节性T细胞（induced regulatory T cell，iTreg），iTreg 的免疫调节功能是抑制效应T 细胞产生外周耐受的关键。

探究PD-1 通路抑制自身免疫性疾病的机制是近年来的研究热点。PD-1 通过招募蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2［9］，抑制TCR 近端酶的激活及下游事件启动，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/PKB 或PI3K/AKT）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是其中最经典的2 条信号转导通路。蛋白磷酸酶和张力蛋白同系物（protein phosphatase and tensin homolog，PTEN）是一种细胞磷酸酶，PD-1活化可使PTEN 的活性增强，进一步抑制PI3K/AKT信号通路的激活［16］。此外，PD-1 阻断PI3K/AKT 通路会抑制细胞抗凋亡基因BCL-XL（B-cell lymphoma/leukemia-x long），引起IL-2 的生成减少，进一步诱导CD8+T 细胞和CD4+T 细胞无能。MAPK 信号转导通路是PD-1/PD-L1 通路介导抑制作用的另一个关键信号靶点，参与细胞外信号向细胞内应答的转换，并通过磷酸化激活来调控细胞增殖、分化、侵袭、转移和死亡。c-Jun 氨基端激酶（c-Jun amino-terminal kinase，c-Jun）、p38 MAPK 和胞外信号调节激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）是参与MAPK 通路的3 条平行通路分子［17］。PD-1 与PD-L1的相互作用可以通过促进ERK 磷酸化，激活酪氨酸激酶，以自分泌或旁分泌形式持续产生活化配体，引起Ras 突变和B-Raf 突变，从而导致肿瘤的发生以及肿瘤耐药性的产生［18-19］。STUTVOET 等［20］也发现PD-1/PD-L1 轴与MAPK 通路存在关联，抑制MAPK通路可抑制肺腺癌细胞中表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）和IFN-γ 诱导的PD-L1mRNA和蛋白的上调。

此外，PD-1 介导的抑制信号取决于TCR 信号的强度，低水平的TCR 刺激下会产生更大的抑制作用，CD28 或IL-2 的共同刺激则可以减弱PD-1 的抑制作用［21-22］。CD28 和IL-2 都通过影响细胞抗凋亡作用、细胞周期和细胞因子基因来促进T 细胞扩增。

2 PD-1与自身免疫性眼病

2.1 自身免疫性葡萄膜炎

葡萄膜炎可按病因学分为感染性葡萄膜炎和非感染性葡萄膜炎，其中后者主要与自身免疫反应有关，包括自身免疫性葡萄膜炎、特发性葡萄膜炎、风湿性疾病伴发的葡萄膜炎、创伤继发性葡萄膜炎和伪装综合征等［23］。自身免疫性葡萄膜炎的病变部位广泛，严重时可致盲，主要发病机制是由于包括Th1 和Th17 在内的T 细胞亚群失调和功能障碍［24-25］。致病性Th17 细胞为CD4+T 细胞中一个亚型［26］，研究［27］发现其与自身免疫性葡萄膜炎发病相关：致病性Th17 细胞分泌的IL-17 可能引起视网膜色素上皮细胞功能障碍，从而导致疾病的发生发展。

在自身免疫性葡萄膜炎患者中，外周血淋巴细胞中PD-1、PD-L1及PD-L2的mRNA 表达降低，活动期患者降低幅度更大［28］。对实验性自身免疫性葡萄膜炎（experimental autoimmune uveitis，EAU）小鼠模型的研究［29］发现，PD-1 在正常和EAU 小鼠的视网膜中均表达，而在炎症活动期，PD-L1 和PD-L2 在眼部浸润的炎症细胞、血管和视网膜中表达明显降低。LEE等［30］发现抑制自身免疫反应可以使EAU炎症好转，PD-1 及其配体在眼部的高表达与EAU 由活动期向静止期转变有关：Treg被共刺激分子和细胞因子刺激分化为iTreg，iTreg 通过上调PD-1 和PD-L1 的表达抑制T 细胞的自身免疫反应，随后导致效应T 细胞的IFN-γ 产量减少，转化生长因子-β 分泌增多，最终使EAU疾病进程中止。

除基础研究外，在近几年临床癌症免疫疗法的相关报道中，PD-1 抑制剂针对癌细胞的T 细胞反应导致的自身免疫性并发症时有发生，进一步表明PD-1通路的失效可能与自身免疫性葡萄膜炎的发生发展有关。自2014年9月美国食品药品监督管理局批准使用PD-1 抑制剂帕博利珠单抗（pembrolizumab）以来，有多个研究［31-33］表明葡萄膜炎是PD-1 抑制剂的不良反应之一。

2.2 甲状腺相关眼病

甲状腺相关眼病是一种自身免疫性眼眶病，涉及多系统损害，与甲状腺疾病密切相关，发病率在成年人眼眶疾病中居第一位［34］。此前研究发现，甲状腺相关眼病的发病包括以下机制：机体对自身促甲状腺激素受体（thyroid-stimulating hormone receptor，TSHR）的耐受遭到破坏，抗原提呈细胞及B 细胞对TSHR 表位进行识别，初始Th 细胞被TSHR 肽段激活，分化为不同的亚群，即产生IFN-γ 的Th1 细胞、产生IL-4 的Th2 细胞和产生IL-17A 的Th17 细胞。外周血CD34+纤维细胞浸润眼眶结缔组织，转化为CD34+成纤维细胞，产生趋化因子募集Th1和Th17细胞。Th 细胞产生的细胞因子与浆细胞产生的自身抗体共同作用于眼眶成纤维细胞，从而加剧眼眶炎症［35］。

研究证实甲状腺相关眼病患者外周血CD4+、CD8+T细胞表面PD-1表达率较对照组下降，活动期及中重度患者经糖皮质激素冲击治疗后外周血CD4+、CD8+T细胞表面PD-1表达上调，可能是通过抑制该疾病的自身免疫反应发挥作用［36］。Treg即CD4+CD25+T细胞［37］，占外周血CD4+T 细胞的5%～10%，Treg 功能障碍已被证明是多种自身免疫性疾病发病的重要危险因素［38］。作为T 细胞激活负调控的免疫检查点，CTLA-4 在Treg 上表达［39］。而且，重度甲状腺相关眼病患者眼眶组织及外周血CTLA-4 表达低于轻度患者，推测CTLA-4 参与甲状腺相关眼病的发生发展［40］。SAGIV 等［41］描述了3 例接受免疫检查点抑制剂治疗的癌症患者，均在接受CTLA-4 抑制剂和PD-1 抑制剂的组合治疗后出现甲状腺相关眼病样眼眶病变。CTLA-4 与PD-1 同为T 细胞负调控共刺激分子，因结合位点重叠，两者间存在相互抑制作用，该抑制作用可能导致Treg 无法活化，具体机制尚不明确［13］。上述研究均提示阻断PD-1/PD-L1 通路可能导致甲状腺相关眼病的发生及发展。

2.3 干燥综合征相关型干眼症

干燥综合征作为一种系统性自身免疫性疾病，以免疫细胞浸润并破坏各外分泌腺体为主要特征。当该疾病累及眼部时，表现为干眼症，患者以畏光、眼干等不适为主，为干燥综合征相关型干眼症［42］。其发病机制尚不明确，且无统一诊断及治疗标准。

KOBAYASHI 等［10］研究表明干燥综合征的发生可能与PD-1/PD-L1 通路功能障碍有关。其研究发现干燥综合征患者唾液中淋巴细胞数量明显高于健康对照组，淋巴细胞中PD-1 的表达水平明显高于健康对照组；同时，PD-L1在患者的唾液腺导管和腺泡上皮细胞中高表达，但在正常唾液腺中不表达；相较于无淋巴细胞浸润的唾液腺，PD-L1在有淋巴细胞浸润的唾液腺中表达更高。另有研究［43］表明，PD-1/PD-L1作为抑制性共刺激分子，在干燥综合征患者中作为保护性分子继发性增多，并与疾病损害程度及预后相关；PD-L1 的表达水平与炎症严重程度呈负相关，PD-L2 则与炎症严重程度无明显相关性。提示PD-1/PD-L1通路可能在干燥综合征的免疫病理损害中起保护作用：淋巴细胞持续大量的局部浸润，过度活化的T 细胞导致PD-1 及其配体继发性上升，PD-1/PD-L1发挥免疫负调控，限制自身免疫性疾病的发生发展。

2.4 视神经脊髓炎谱系障碍

视神经脊髓炎谱系障碍是由自身免疫反应导致的中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病。该疾病以视神经与脊髓同时或相继受累为临床特征，是急性或亚急性起病的致盲性疾病。特异性水通道蛋白4（aquaporin-4，AQP4）抗体（AQP4-IgG）为该病的免疫标志物，研究发现其由CD19+CD27hiCD38hiCD180-表型的B 细胞亚群产生；IL-6在视神经脊髓炎谱系障碍患者中表达升高，可提高该B 细胞亚群的存活率以及其AQP4-IgG 的分泌［44］。在动物模型中进一步发现：通过共刺激分子（例如CD80 和CD40）和细胞因子（例如IL-6 和IL-17）的协同作用，T 细胞分化为AQP4 特异性T 细胞，其可导致血-脑脊液屏障的破坏，使AQP4-IgG 和其他的免疫因子进入AQP4 高表达的区域，从而引起炎症反应［45］。

研究［46］发现，PD-1 和PD-L1 的可溶性形式（sPD-1 和sPD-L1）可能对PD-1/PD-L1 通路有抑制作用：视神经脊髓炎谱系障碍患者早期外周血中，CD4+T细胞表面PD-1，CD19+B淋巴细胞和CD14+单核细胞表面配体PD-L1的表达水平较正常对照组明显升高，且患者外周血中sPD-1 和sPD-L1 水平明显高于对照组。另一研究［47］也证实，sPD-1 和sPD-L1 可通过抑制PD-1/PD-L1 通路增强T 细胞活性。故该抑制作用可能在一定程度上干扰了细胞膜上的PD-1/PD-L1负信号转导，破坏免疫调节稳态，从而导致自身免疫反应［48］。

3 PD-1/PD-L1 在自身免疫性眼病治疗中的临床应用展望

PD-1/PD-L1 通路在自身免疫调节、肿瘤免疫及慢性病毒感染中均起着重要的作用，是自身免疫性疾病和肿瘤的潜在药物治疗靶点。在自身免疫性眼病领域，未来或可能进一步通过对PD-1 这一靶点的深入研究，实现精准诊断与靶向治疗。

在评估疾病活动性方面，有研究［49］发现，在1型糖尿病的缓解期患者中，外周血CD4+和CD8+T 细胞中的PD-1 和PD-L1 表达较活动期有所上调。尽管具体机制尚不清楚，但这些结果提示：PD-1+和PDL1+在各亚型的T 细胞中表达的变化可能与缓解期患者自身免疫反应的减弱有关。该现象在自身免疫性葡萄膜炎患者和甲状腺相关眼病患者的外周血中也同样存在［28-29，36］。因此，有望将PD-1 或PD-L1 作为一种生物标志物，联合其他在缓解期阶段表达发生变化的潜在靶标，通过免疫学指标定量对患者疾病分期做出精准判断，为自身免疫性疾病提供新的有效诊疗策略。

靶向治疗方面，在类风湿性关节炎小鼠模型中已证实：PD-1与PD-L1在合适浓度下可抑制滑膜及滑膜液中的T细胞增殖，而PD-1在模型小鼠滑膜T淋巴细胞中的表达异常增强，使得自身免疫反应进展；通过腹膜内注射PD-L1融合蛋白结合异常升高的PD-1，可使小鼠发生关节炎的严重程度降低。PD-L1融合蛋白通过结合PD-1 传递抑制信号，能够抑制T 细胞的增殖，降低炎症细胞因子IFN-γ和IL-17A水平，最终通过调节Th1/Th17 途径有效控制疾病的发展。因此，有望将注射PD-L1 融合蛋白作为一种新的治疗手段，降低炎症细胞因子，抑制自身免疫反应，从而缓解疾病［50］。

4 结语

自身免疫性眼病的病程较长，严重时可致盲，严重影响患者的生存质量，且现有治疗手段效果不理想，因此对单抗及免疫抑制剂的研究具有重要价值。PD-1/PD-L1 信号通路作为T 细胞激活、诱导及维持免疫耐受的关键调控因子，已被证明其在自身免疫反应、肿瘤免疫、移植免疫、感染免疫等多个方面均发挥着重要作用。PD-1/PD-L1通路的免疫调节机制及其在自身免疫性眼病中的作用表明，未来靶向治疗自身免疫性眼病具有巨大的潜力，有待进一步探索研究。