精子DNA损伤机制的研究进展

卢慧钰，姚文亮，周玉良，蒋婉雪，虞颖绿，江超仁，陈胜辉*（1.江西中医药大学，江西 南昌 330004；.江西中医药大学附属生殖医院/江西省中医男科疾病重点研究室，江西 南昌 330001）

携带遗传物质的基因组序列信息位于DNA 上，受精时，精子将细胞核中的遗传物质传递给卵母细胞，并与卵母细胞的遗传物质进行融合形成二倍体受精卵，发育成胚胎延续下一代。因此，保护精子DNA的完整性对生命的延续至关重要。

1 精子DNA损伤的介绍

广义上，精子DNA损伤包括线粒体DNA损伤和核DNA 损伤，狭义上是指核DNA 损伤。评价精子DNA 完整性的指标主要用精子DNA 碎片化指数（DFI）来表示，检测的是DNA 单链断裂（SSB）和双链断裂（DSB）。SSB 和DSB 是目前公认的精子DNA 损伤形式［1］，但精子DNA 损伤并不意味着SSB 或DSB，Agarwal 等认为DNA 损伤的类型包括复制过程中碱基错配，无碱基位点，碱基修饰（氧化，烷基化，脱氨基），加合物和链内交联，嘧啶二聚体以及SSB 和DSB[2]。因此，精子DNA 损伤不等同于精子DNA 片段化，现有的检测精子DNA 损伤的方式也没有检测到所有的精子DNA损伤。

2 精子DNA损伤的原因

人体的新陈代谢活动和外界环境均可导致精子DNA发生损伤，分为内源性因素和外源性因素。

2.1 内源性因素精子 DNA 损伤修复失败。DNA按碱基配对进行复制是一个严格而精确的事件，但并不是不会发生错误。为保证遗传物质的完整和稳定，DNA损伤修复机制发挥了至关重要的作用，但其并不能修复所有损伤。相比其他细胞，成熟精子DNA 损伤修复能力较低［3］，这可能是由于精子核DNA 高度浓缩，抑制了DNA 转录的结果。DFI 随着年龄增加而升高［4］，且损伤修复机制的能力会随年龄的增加而呈现下降趋势［5］。同源重组是修复二倍体细胞DSB 的最好方式。而精子是单倍体细胞，相比其他细胞，其损伤修复机制更弱［6］。卵母细胞也能修复精子DNA 的部分损伤，其修复的程度与卵母细胞的质量有关，年龄是影响质量的一个因素。与精子DNA 损伤修复机制一样，卵母细胞修复精子DNA损伤的能力也随着年龄的增加而下降［7］。Salehi 等研究也发现未成熟卵母细胞在体外培养成熟后，其不能修复高水平的精子DNA 损伤且会影响胚胎的质量［8］。这些未能完全修复而存留下来的DNA损伤可能会在适宜的条件下表现出负面的影响。

2.2 外源性因素

2.2.1 精子冷冻损伤 精子冻融过程中极易受到化学和机械性损伤。低温状态下精子DNA 损伤会更加敏感。崔艳颖等［9］发现牛精子DNA完整性会随着冷冻时间的延长而逐渐下降，最终影响受精能力。精液冷冻保存时产生的活性氧（ROS)可以破坏精子细胞核中的DNA结构，造成细胞凋亡。马晓萍等［10］发现不育患者的精液在解冻后精子凋亡率比冷冻前高。

2.2.2 生殖道感染 对衣原体感染的小鼠输精管的精子进行研究发现，精子DNA 损伤的水平增加[11]。生殖道感染可增加精液中的白细胞数量，当每毫升的精液中超过1×106个白细胞时，则导致白细胞精液症的发生。研究表明[12]，过多的白细胞会导致精子DNA完整性受损。这可能是由于白细胞导致ROS的产生，从而导致氧化应激（OS）的发生，损伤了精子的DNA。

2.2.3 环境污染和不健康生活方式 环境中具有生殖毒性的物质可损伤精子DNA。以多溴联苯醚(PBDES)为例，PBDES是一种优良的阻断剂，广泛应用于纺织、家用器具、建筑材料等领域，对生物和人体具有毒害效应。PBDES 可以通过损害精子DNA、生殖细胞功能等影响男性生殖功能［13］。产前暴露于PBDES会导致雄性后代的精子DNA损伤［14］。不健康的生活方式有吸烟、喝酒、熬夜、久坐等。以吸烟为例，DFI与吸烟呈正相关关系［15］，对不育的吸烟患者进行研究，发现其DFI 增高［16］。吸烟对精子DNA 损伤的机制有待进一步阐明，可能是由于香烟烟雾中有许多对人体有毒害作用的成分，如尼古丁、焦油、一氧化碳等，与机体产生了生殖毒性作用。近来有研究发现，吸烟患者中的激酶1（Chk1）表达下降，而Chk1的表达与精子DNA 损伤和发生凋亡相关，其减少可能导致精子损伤修复机制的下降和精子凋亡增加［17］。

3 精子DNA损伤的起源机制

关于精子DNA 损伤的起源，目前比较支持的是精子细胞凋亡、精子染色质成熟受损、氧化应激三个方面［18-19］。

3.1 精子细胞凋亡 细胞凋亡是由基因控制的细胞自主的有序死亡，一个显著的特征就是染色体DNA的降解。睾丸生殖细胞的凋亡是维持睾丸稳态所需要的基本且复杂的过程，为控制正常生殖细胞的数目和质量起着重要的作用。生殖细胞的凋亡一般发生在生精过程的某个特定阶段，然后由吞噬细胞将其清除。若发生不正常的精子凋亡而没有及时被清除，异常精子数量就会增多。研究表明［20］，精子射精后具有细胞凋亡的能力，这种能力可致线粒体完整性受损、核被膜缺陷和核碎裂的凋亡迹象，影响受精潜能。Fas系统（Fasl、Fas）的是一种广泛认可的细胞凋亡途径，Fas 配体（Fasl)与Fas 受体表达阳性的细胞结合能导致其发生凋亡。对小鼠进行研究，证实Fas / Fasl 的高表达会诱导其睾丸细胞发生凋亡［21］。不育组男性中检测到Fas 表达阳性而在可育组中未检测到［22］。

3.2 精子 染色质受损与其他体细胞核不同，为保证精子的遗传物质的稳定性，降低在传输过程中受到的损害，精子核染色质呈高度浓缩，抑制基因的表达[23]。浓缩涉及到精子的重塑，DNA 双链先进行生理性的断裂，断裂位点在各种DNA 聚合酶的作用重新结合，这一过程过渡蛋白会替代大部分的组蛋白，染色质组织被改变，然后由鱼精蛋白取代过渡蛋白[24]。浓缩是成熟精子核DNA与鱼精蛋白紧密结合的结果，因为鱼精蛋白比组蛋白更小，可以提高精子DNA的浓度。若精子发生过程中发生组蛋白修饰异常和鱼精蛋白的缺陷，则可能会出现精子染色质结构异常。且精子细胞中鱼精蛋白1 与鱼精蛋白2 的比值下降会导致DFI的上升［25］。

3.3 氧化应激 Bisht［26］认为精子DNA 损伤的主要是由氧化应激（OS）导致的。一定的活性氧（ROS）对机体有好处，但过多会使机体的抗氧化系统失去平衡，导致OS。OS 能破坏精子的功能和结构，导致精子易碎的敏感性增加。不同于其他细胞，精子细胞膜富含不饱和脂肪酸，且精子细胞在变形过程中脱落了大部分的细胞质，因此更易受OS损伤［27］。OS导致脂质过氧化产生了醛，损坏精子细胞膜结构，使精子核DNA 直接暴露于精浆中。线粒体是ROS 的一个重要来源，超水平的ROS会导致线粒体DNA（mtDNA）的突变。在存在生育问题的男性中发现mtDNA突变也证实了这一点［28］。

4 精子DNA损伤检测在临床男科应用的挑战

常规用于精子DNA 碎片的检测方式主要有四种，TUNEL、SCSA、SCD、Comet。到目前为止，DFI 仍没有作为各大生殖中心的一个常规检测［29］。美国生殖医学学会也不推荐将DFI作为评估男性不育的常规检测应用于临床［30］。对于DFI在辅助生殖男科中应用困难，我认为主要有以下几点：（1）目前仍没有一个指南明确规定精子DNA 的检测方法，也没有明确参数的阈值。各个实验室之间使用的检测方法不同，这可能导致评估精子DNA 完整性的方法不能可靠地预测对殖结局的影响。（2）每个精子DNA 损伤的检测方法都是有侧重点的。有荟萃分析表明，在评估精子DNA完整性的测量方法中，TUNEL和Comet 相比SCSA 和SCD 来说，准确度更高，这有可能是因为前者使用的是直接测定的方法，而后者是间接测定［31］。（3）常规的检测方法主要是对精子染色质SSB 和DSB 的检测，其可能只是发现了小部分的精子DNA 损伤。这些测试中的每一个都提供了DNA总体状态的半定量估计（TUNEL、Comet），但没有提供可能受到影响的特定DNA序列的指示。

5 精子DNA碎片对妊娠结局的影响

虽然Green 等［32］认为ICSI受精当日的精子DNA损伤程度与临床妊娠率无关。但研究表明［33］，通过DFI 值可以挑选出不适合用于辅助生殖的精子，且DFI 可用于评估男性不育［34］。高DFI 虽没最终决定胚胎的质量，但会导致早期胚胎细胞分裂的延迟［35］。与之相反的是，Simon等［36］荟萃分析有足够的证据表明精子DNA 损伤对于辅助生殖临床妊娠结局具有负面的影响。精子DNA 损伤会降低胚胎质量且增加ICSI 周期中植入失败的风险，导致临床妊娠率下降［37］。金保方［38］还认为，精子DNA 损伤是造成复发性流产（RSA）的一个相关因素。

6 治疗

对于精子DNA 损伤的治疗，至今无特效药物，也没有公认的治疗方案。

6.1 中医治疗 从精子染色质损伤后对生殖结局的影响来看，可归于中医学上的“无子”、“难嗣”等范畴，肾主生殖，总体上离不开从肾论治。吴堪助等［39］认为精子染色质损伤属肾阴亏虚，以滋阴补肾为法，研究左归丸加味治疗精子染色质损伤，发现其能降低DFI。姚文亮等［40］认为精子DNA损伤与肾功能失调有关，运用补肾强精颗粒治疗，能显著改善精子DNA损伤。肾虚日久可致瘀，门波以温肾填精、祛瘀生精为法，以补肾生精方加减治疗不育症患者，能显著降低DFI［41］。综上医家通过补肾填精，兼活血化瘀等方面治疗男性不育，可降低DFI。近代的药理学的研究发现，补肾和活血的药物具有抗氧化作用，可清除机体过多的ROS，中药的作用可能是通过降低OS改善DNA损伤治疗男性不育。

6.2 西医治疗 目前对于精子DNA 损伤的治疗主要是抗氧化剂的使用，抗氧化剂的补充有利于应对OS 带来的损害。Smits 等［42］荟萃分析表明，在生育能力较弱的男性中补充抗氧化剂，可以提高胎儿的活产率。左卡尼汀（左旋肉毒碱）是一种抗氧化剂，商学军等［43］运用左卡尼汀治疗男性不育，发现其对精子DNA 有良好的保护作用。维生素和微量元素中很多也具有抗氧化作用。在精子冷冻保护剂中添加维生素E 能够缓解冻融过程中对精子的损害，一定程度上能够提高精子DNA的完整性［44］。锌疗法能够对抗氧化应激损伤，降低精子DNA 损伤［45］。

除了药物方面的治疗外，生活方式的改变也可降低DNA 损伤，Bisht 认为OS 可由多种因素导致，生活方式的干预，例如瑜伽和冥想都可降低氧化损伤，进而降低DFI［26］。

现有的研究支持精子DNA 损伤对妊娠结局存在影响，DFI 数值正成为解释男性不明原因不育的有力工具。虽然临床上对于精子DNA 损伤仍没有特效的药物与特定的治疗方案，但了解其发生的原因与机制，有助于我们在未来寻求合适的治疗方法，对男性不育患者的临床治疗有重要意义。