非洲猪瘟的诊断与安全防控管理

刘中杰

(四川省岳池县九龙畜牧兽医站，四川 岳池 638300)

0 引言

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒感染引发的高度接触性传染病，该病毒的环境适应性较强，除病猪作为传染源外，软蜱也可作为传播媒介扩大病毒流行范围，加大非洲猪瘟防治管理难度。病猪感染强毒株后以最急性、急性病例为主，出现典型的发热、虚弱、呕吐、咳嗽、皮肤发绀、内脏出血等症状，妊娠母猪会出现流产，急性病例发病率和死亡率为100%，亚急性、慢性病例发病率分别为55%、30%[1]。由于非洲猪瘟目前仍无特效药且危害性大，一旦出现感染，必须及时进行扑杀和无害化处理，避免给养猪户和区域生猪产能造成严重影响。因此，各大养殖户和企业要重视非洲猪瘟的防控，掌握基本的诊断方法，若有相似症状需要及时上报、隔离，切断非洲猪瘟病毒的传播途径，将损害降低到最小。

1 病原学概述

非洲猪瘟的临床表现多样，具有不易辨识、病程短、致死率高等特点。非洲猪瘟病毒不仅是一种线性双链DNA，同时还是唯一一个虫媒DNA病毒，即可通过软蜱进行病原体传播，目前只感染家猪和野猪，人类或其他动物接触病毒后无典型感染症状，但可作为非洲猪瘟病毒的传播媒介感染健康猪群。非洲猪瘟病毒血清型多样，且存在较强的变异能力，因此无特效药和疫苗。国际上根据其p72基因末端的核酸片段(大小为478个碱基)将其分为24个基因型，我国感染的非洲猪瘟病例中以基因Ⅱ为主。该病毒的环境适应较强，可在粪便中存活2周左右，在病猪尸体及周边环境中存活数个月，在生肉、未完全熟制的猪肉制品(如熏肉、腌肉)和食品剩余物内可存活几个月。虽然目前无人类感染病例报道，但是该病毒可污染饲养员衣物或鞋底，猪若接触污染物后可感染病毒[2]。非洲猪瘟病毒不耐高温，56℃ 70 min或60℃ 20 min可杀灭病原体，但非洲猪瘟病毒耐低温，4℃条件下可存活1年，在无血清pH 4.0～11.0条件下毒力较为稳定，若有血清存在，其稳定的pH范围可扩大到4.0～13.4。非洲猪瘟病毒对乙醚、氯仿化学试剂敏感度高，将病毒污染物分别置于0.3%福尔马林、1%氢氧化钠、3%邻苯基苯酚试剂中30 min，均可有效灭活病原体。

2 流行病学

2.1 传染源

感染非洲猪瘟病毒的病猪或带毒的家猪、野猪、软蜱及病毒污染物为主要的传染源。

2.2 传播途径

一是直接接触感染，病猪感染后，非洲猪瘟病毒可在其粪便、尿液、唾液、眼泪、鼻腔分泌物、阴道分泌物中存在，这些病毒具有较高的毒性，与健康猪接触后可感染非洲猪瘟病毒。此外，带毒针头也可扩散该病毒[3]。二是间接接触感染，非洲猪瘟病毒污染人员、车辆或用具，当猪群与非洲猪瘟病毒污染物接触后可感染。同时，养殖人员携带非洲猪瘟病毒污染的猪肉制品也可将病原体带入猪场，泔水喂猪也会增加非洲猪瘟病毒感染概率。三是软蜱叮咬感染，感染非洲猪瘟病毒的软蜱在叮咬生猪时可直接传播病毒。

2.3 易感动物

家猪、野猪均是非洲猪瘟病毒的易感动物。目前无牛、羊、犬、猫等感染的病例报道。

2.4 流行季节

非洲猪瘟全年均可发病。

3 初步诊断

3.1 发病症状

病毒的潜伏期短，自然感染潜伏期一般为1周，临床试验感染为3 d左右，病程可持续4～19 d，发病症状和病程与病毒毒力有关，目前主要分为3种类型毒株:强、中等、低毒力毒株。

3.1.1 最急性和急性型

引发最急性和急性症状的非洲猪瘟病毒为强毒力毒株，最急性病例由于病程短、病情急，主要以突然死亡为主。急性病例可持续2～4 d，病猪发病后出现高热，体温温度可升至42℃，病猪食欲废绝，精神萎靡，往往缩在猪舍一角，耳尖皮肤发绀，有明显的虚弱、无力症状，呼吸困难，有咳嗽症状，鼻腔内有浆性黏液流出，病猪伴有呕吐，腹泻，随着病情发展，病猪粪便中有血液。这两种类型症状的死亡率达100%[4]。

3.1.2 亚急性型

引发亚急性症状的非洲猪瘟病毒为中等毒力毒株，病猪感染非洲猪瘟病毒后出现发热、食欲下降、低头消沉，病猪呼吸不畅、咳嗽、打喷嚏、喜卧，驱赶行走时伴有疼痛感。随着病情发展，病猪的关节处有肿胀，耳尖、前后肢皮肤颜色呈紫红色。若发现不及时，可在感染后1～3周出现死亡，病死率55%±15%。

3.1.3 慢性型

引发慢性症状的非洲猪瘟病毒为低毒力毒株，慢性型非洲猪瘟的病程相对缓慢，非洲猪瘟病毒可潜伏2～3周后才出现轻度发热，病猪有呼吸急促、关节肿胀症状，耳部、腹部和大腿内侧的皮肤出现局部红斑，妊娠母猪会出现流产症状。慢性型非洲猪瘟和猪瘟、猪丹毒、猪肺疫、猪副伤寒具有一定的相似性，慢性型非洲猪瘟死亡率约为30%。

3.2 病理变化

3.2.1 最急性和急性型

最急性型非洲猪瘟的病猪全身器官有明显的出血症状，尤其是全身淋巴组织会出现炎症的出血。急性型非洲猪瘟的病猪主要病变器官为淋巴结、血管，病猪皮下出血，皮肤多处有深红色的疹块。脾脏肿大至正常脾脏体积的4.5±1.5倍，脾脏呈黑紫色，严重充血，质地变脆。病猪淋巴结肿大、出血，花纹如大理石状，肾脏、肝脏质地变脆，有出血、充血症，肾脏和膀胱表面还有许多淤血点。病猪的肺部出现严重的水肿，病猪心内、外膜有出血点。

3.2.2 亚急性型

亚急性型非洲猪瘟的病猪剖开腹腔后可发现大量积液，病猪的脾脏肿大、出血，病猪的颌下腺、咽喉、肠系膜等淋巴结水肿、出血，肾脏出血严重，其出血症状要比急性型非洲猪瘟出血面积大且严重。病猪心包积液，肝脏和胆囊也有水肿症。

3.2.3 慢性型

慢性型非洲猪瘟的病猪淋巴结肿胀，有局部出血症，脾脏颜色正常，但体积变大。病猪肺部炎症突出，有干酪样坏死，病猪心脏无出血，但呈纤维性心包炎。慢性型病猪的扁桃体会有坏死灶，而急性、亚急性则无该特征。

4 实验室诊断

4.1 实时荧光PCR检测

检测原理为PCR反应中加入荧光基团(非洲猪瘟检测的荧光基团为5-羧基荧光素)，利用荧光信号积累对整个PCR扩增过程进行实时检测，结果以标准曲线和Ct值进行定量分析。

4.1.1 样品前期处理

该方法适用于病死猪的淋巴结、脾脏或病猪血液的检测，待检样品应在生物安全柜中进行，0.15 g组织可用PBS(0.1 M，pH=7.2)匀浆处理，经10 000 g离心3 min后吸取上清，1 mL全血样本直接置于离心管内，将这些不同的病料置于60℃恒温水浴锅灭活30 min，灭活后样本可置于4℃贮藏，时长小于24 h，若长时间保持应置于-70℃的温度条件下。

4.1.2 病毒DNA提取

向3个离心管内加入200 μL DNA提取液1(PEG8000粉末207.4 g、氯化钠175.3 g，用DEPC水定容至1 L)，分别加入处理好的样本、阴性、阳性对照，混匀后在4℃下10 000 g离心15 min后吸取上清到新的离心管内，分别加入10 μL DNA提取液2(氯化钾129.1g、乙二胺四乙酸146.1g、Tirs碱121.1g、氢氧化钠6g、浓盐酸1.21 mL，用DEPC水定容至1 L)，混匀后在4℃下2 000 g离心10 s，沸水浴10 min，加入90 μL DEPC水，10 000 g离心15 min后吸取上清到新的离心管内，即为DNA。

4.1.3 荧光定量PCR检测

将配置好的荧光定量PCR反应液(总体积为20 μL)内加入5 μL DNA溶液，混匀，瞬时离心后置于荧光定量PCR仪器内，经过PCR反应过程收集CT值，结合PCR的荧光曲线读取结果。

4.1.4 结果判定

试验成立的前提:阳性对照的CT值不大于28，且扩增曲线呈S型，阴性对照无CT值且扩增曲线成直线。

样本结果读取:若CT值不大于38，且扩增曲线呈S型则为阳性样本；若CT值大于38且扩增曲线呈S型则需要进行重检；若无CT值且扩增曲线成直线则为阴性样本。

4.2 ELISA检测

检测原理为抗原抗体的结合反应，通过加热与酶反应的底物后进行显色，根据颜色进行定性(有无颜色变化)或定量(颜色深浅)分析。

4.2.1 样品前期处理

该方法适用于病死猪的淋巴结、脾脏或病猪血液(置于抗凝管内)的检测，组织样本通过PBS(0.1 M，pH=7.2)匀浆处理后，经3 000 g离心20 min后吸取上清，血液样本经3 000 g离心20 min后吸取上清。

4.2.2 试剂准备

试验前30 min将试剂、样本置于25℃室温条件下自然平衡。根据非洲猪瘟抗体(非洲猪瘟)Elisa试剂盒说明书准备不同稀释比例的标准品，然后将检测溶液A、B分别离心、稀释，对洗涤液进行稀释，分装底物溶液。

4.2.3 ELISA检测

试验在96孔板内进行，分别添加标准品、待检样品、空白对照，7个标准品孔内分别加入不同稀释比例的标准品，待检样品孔内加入100 μL处理好的样本，空白孔加入100 μL DEPC水。覆盖膜置于37℃恒温箱孵育120 min。倒掉孔内液体，甩干。每孔分别加入100 μL的检测溶液A，覆盖膜置于37℃恒温箱孵育60 min。倒掉孔内液体，每孔分别加入300 μL稀释好的洗涤液，室温静置90 s，翻转96孔板置于吸水纸上层，拍打将液体流入吸水纸内，反复洗涤3次。每孔分别加入100 μL的检测溶液B，覆盖膜置于37℃恒温箱孵育60 min。倒掉孔内液体，每孔分别加入300 μL稀释好的洗涤液，室温静置90 s，翻转96孔板置于吸水纸上层，拍打将液体流入到吸水纸内，反复洗涤5次。每孔分别加入90 μL底物溶液，覆盖膜后包上一层锡箔纸置于37℃恒温箱孵育20 min，若标准品孔呈梯度蓝色，可以在每孔内加入50 μL终止反应液，蓝色孔会立即变为黄色，轻轻晃动使溶液混匀。

4.2.4 结果判定

切开覆膜，置于酶标仪下进行光密度值读取，波长检测值为450 nm。根据标准曲线的公式来确定定量结果。

5 非洲猪瘟的安全防控管理

5.1 猪群和猪舍管理

5.1.1 引种规范

由于非洲猪瘟在我国已有流行，猪场最好秉持“自繁自养”原则，减少引种，这样可以杜绝因引种带来的外部非洲猪瘟病毒发生[5]。如需要引种，首先要确定引种地区为非洲猪瘟非疫区，其次要规范引种操作步骤。引种猪只入场前先置于隔离区进行30 d的专人饲养，并定期对其进行健康检查，30 d隔离期结束后采集血液样本，进行非洲猪瘟病毒和其他疫病的血清学检测，若均为阴性则合群饲养。

5.1.2 猪舍消毒

非洲猪瘟病毒虽然环境适应强，但对苯酚、碘伏等消毒剂仍较为敏感，因此在非洲猪瘟流行期间可以选择非洲猪瘟病毒敏感的化学试剂进行消毒[6]。猪场内每周消毒一次，选用碘化物试剂喷洒消毒，冬季可选用干粉消毒，减少体表液体蒸发以避免出现感冒。猪舍过道用10%石灰水喷洒消毒。

5.1.3 防蜱灭鼠

从非洲猪瘟传染源来看，猪场还要做好防蜱灭鼠工作[7]。猪舍地面、墙壁的裂缝、孔隙都需要用水泥添堵，猪舍外的杂草要及时拔除，软蜱流行季节要在猪舍四周喷洒敌百虫试剂来灭蜱。老鼠可用粘鼠板或灭鼠器来捕抓，鸟类可设置防鸟网。

5.2 人员管理

5.2.1 树立安全防控意识

养殖户要加强非洲猪瘟的安全防控意识，猪场要定期对人员进行非洲猪瘟传染病的防控培训，从理论层面了解非洲猪瘟的危害、传播途径和发病症状，一旦出现类似感染病例及时上报和隔离，减少因人员疏忽造成的病原体扩散。

5.2.2 制定人员管理制度

①猪场要规范人员进出管理，养殖人员在工作期间减少出场次数，进出场区都要按规定进行沐浴、衣物更换和紫外消毒，并在生活区至少隔离48 h后才能进入生产区，且进入生产区前仍按规定进出消毒。同时，养殖人员不能随意串舍，外来人员不能随意进入到生产区内。②猪场要对人员进出场携带物进行检查，严禁工作人员携带生猪肉、猪肉制品入场，若有携带需要在场外进行完全蒸熟处理，场区工作衣物、生猪制品也不能带出场外[8]。同时，进入生产区、猪舍内的养殖人员要佩戴橡胶手套，穿戴专门的衣物、鞋子，这些用品每天都要经过紫外消毒和定期的化学试剂浸泡消毒，以防因人员衣物携带非洲猪瘟病毒而感染健康生猪。

5.3 车辆管理

5.3.1 严格管控外来车辆

①外来车辆尤其是非本场运载生猪车辆要远离猪场，需要猪场在距离场外500 m处设立提示牌。②规模化猪场要在距离场外1 km处设立中转站，若出现猪传染性疾病，饲料、物资等通过该中转站进行转运，降低车辆携带病原体出场的风险。③猪场进入、外出车辆为单向通道，凡入场后必须按照规定的路线行驶，不能随意下车、胡乱穿行。

5.3.2 进出场车辆严格消毒

①做好登记管理，进出场车辆要对司机姓名、单位、运输物品等进行登记。②场内工作人员穿好隔离服后对入场车辆进行表面、内部消毒，车表面包括车身、底盘、车轮等进行污泥清除，车内部包括车厢内地面、内壁、方向盘等进行擦拭清洁。基本清扫后驶入入口处的消毒池内，驾驶员佩戴一次性鞋套进入人员消毒室进行紫外线、喷雾消毒(可选用0.1%新洁尔灭)，车轮则停在消毒池，消毒液可选用2%～5%烧碱，消毒池内的液体每周至少更换2次，且液面高度要高于车辆的轮毂，消毒池的长度应是车辆周长的2～4倍，消毒池停留20 min后再进行清水冲洗，清洁消毒后的车辆可以进入猪场。

5.3.3 专车专用

猪场应根据养殖规模配置足够数量的车，运输生猪、饲料、废弃物、病死猪等车辆不能混用，并定期进行消毒处理。

6 结语

为科学防控非洲猪瘟，养殖户首先要对非洲猪瘟的发病机理进行初步了解，并明确病原体特征和流行病学，这样才能选择合适的消毒试剂和病毒处置方法。在认清非洲猪瘟发病症状后，若出现相似病例可以及时进行隔离和消毒，并根据上级部门紧急处置方案进行相关操作。由于非洲猪瘟的传染性和危害性较大，猪场要制定科学的生物安全防治管理制度，做好猪、人、车管理，避免因管理疏忽和疫病认知不清而导致非洲猪瘟流行。