诊疗一体的吲哚菁绿纳米体系介导的光热疗法在多模态抗肿瘤治疗中的应用进展

周晓，金观桥

(广西医科大学附属肿瘤医院医学影像中心 广西临床重点专科(医学影像科)广西医科大学附属肿瘤医院优势培养学科(医学影像科)，南宁 530021)

光热疗法是利用光热纳米材料将外界光源(一般为近红外光)的光能转化为热能，然后靶向诱导肿瘤细胞凋亡/坏死的一种治疗方式[1-2]。光热疗法的抗肿瘤效果在很大程度上依赖于光热纳米材料[3]，光热纳米材料主要包括贵金属纳米材料、碳纳米材料、金属与非金属化合物纳米材料以及有机纳米材料[1,4]。目前，光热疗法使用的材料大多为无机纳米材料，难以生物降解及长期毒性限制了其临床应用。而有机纳米材料具有化学结构易于调节、生物相容性好、细胞和血液毒性更低、在生物系统中更易代谢等特性[5-7]，近年来引起人们的极大关注。有机光热纳米材料主要包括有机染料和共轭聚合物，前者包括吲哚菁绿(indocyanine green，ICG)、卟啉脂质体、普鲁士蓝等；后者则包含聚苯胺、聚吡咯、聚噻吩等[8- 9]。近年来基于ICG的成像及光热特性，相关研究人员设计了生物相容性好、可生物降解的ICG纳米体系，并考察了其在肿瘤成像与诊断、靶向运输与光热联合治疗等方面的作用，有望为肿瘤诊疗带来新希望[10-15]。现就基于诊疗一体的ICG光热纳米体系在光热协同抗肿瘤领域的应用进展予以综述。

1 ICG纳米体系概述

ICG在临床上已被证实是安全的，在808 nm激光照射下具有近红外荧光成像及良好的光热转换能力。ICG作为一种有效光热剂，可以将光能转换为热能并产生单线态氧[16]。然而作为一种有机小分子，由于游离ICG存在聚集倾向、水稳定性和热稳定性差、体内排泄快等缺点[17]，在肿瘤光热疗法中的应用受到限制。为了克服实际应用中的这些困难，相关研究人员设计了生物相容性好、稳定性好的ICG纳米体系，即相关载体与ICG以特定的方式相结合，目前包裹ICG的载体主要包括脂质体[18]、聚合物[19]、无机纳米粒子[20]、生物复合物[21]等。这种基于ICG纳米体系的光热抗肿瘤联合治疗为肿瘤的临床诊疗提供了一种新策略。

2 ICG纳米体系在肿瘤诊断及协同治疗中的应用

ICG纳米体系具有多种成像功能，可协助肿瘤诊断，同时基于ICG纳米体系介导的光热疗法和其他抗肿瘤疗法联合应用可以改善整体治疗效果。

2.1光热疗法协同光动力疗法 光动力疗法依靠特定波长的激发光在氧分子存在的情况下激活光敏剂并选择性地滞留在肿瘤组织，导致肿瘤细胞凋亡/坏死[22]。然而缺氧状态和选择性差会显著影响光动力疗法的治疗效果并限制其临床应用。光热疗法诱导的热疗可以通过增强细胞对光敏剂的摄取而增加肿瘤细胞中活性氧类的浓度，从而增加血氧饱和度。另一方面，光动力疗法诱导的瞬时血管收缩可延长热疗时间。光疗是由光热疗法和光动力疗法介导的肿瘤消融和生长抑制的光触发治疗，两者联用的疗效优于单一疗法[14,23-25]。Wu等[18]通过特定的修饰方式制备了一种由iRGD(一种氨基酸序列为CRGDKGPDC的环状肽)、ICG和脂质体(liposomes，LIP)组成的针对喉癌治疗的靶向多功能纳米粒子iLIPICG，其在荧光成像和光疗方面表现出了良好的性能。体外实验表明，iLIPICG联合激光照射组的Hep-2细胞死亡数明显多于游离ICG+激光组、LIPICG+激光组和磷酸盐缓冲液+激光组。动物实验显示，iLIPICG在Hep-2移植瘤小鼠体内具有良好的血液循环和肿瘤聚集能力，在808 nm激光照射下，iLIPICG可以同时产生高温和活性氧类，并通过ICG产生荧光引导效应来消融喉癌细胞。与游离ICG相比，iLIPICG作为肿瘤靶向载体可提高ICG在体内的稳定性并在荧光成像及影像引导的光疗作用下有效消融Hep-2细胞。总之，iLIPICG的多功能特性为实现喉癌的精确成像和有效的光疗提供了一种有前景的策略。Xu等[26]首次从家蚕茧中提取出了生物相容性丝素蛋白，并用丝素蛋白与ICG构建了针对胶质母细胞瘤的诊疗一体化生物相容性纳米平台ICG-丝素蛋白纳米粒子。ICG-丝素蛋白纳米粒子在体外具有ICG缓释特性，且在近红外照射下较游离ICG表现出更稳定的光热性能。ICG-丝素蛋白纳米粒子在体外易被C6胶质细胞瘤内化，并且ICG在细胞质内有较强的红色荧光，可用于细胞成像。体内荧光成像显示，ICG-丝素蛋白纳米粒子通过静脉注射可在移植瘤部位有效积聚，协同光疗可明显抑制肿瘤生长。因此，ICG-丝素蛋白纳米粒子可能为荧光成像及影像引导的肿瘤光疗提供一种有效的手段。

2.2光热疗法协同免疫治疗 免疫疗法能够通过训练或刺激机体固有的免疫系统来攻击肿瘤细胞，诱导长期的肿瘤抵抗力，但部分原发肿瘤病灶很难用免疫疗法根除。而光热疗法在原发性肿瘤的治疗中能提供强有力的辅助治疗。两种疗法的结合使针对不同形态肿瘤的协同治疗成为可能[19,21,27]。

Pan等[21]将卵清蛋白作为载体，与ICG按照一定的比例在室温水溶液中混合，得到了多功能卵清蛋白-ICG纳米疫苗。经卵清蛋白稳定化后，ICG的光稳定性也有明显提高。该纳米疫苗具有较好的近红外荧光成像能力、光热转换能力以及良好的水溶性、稳定性和生物相容性等。体外实验结果表明，与单一激光治疗相比，经该纳米疫苗孵育的B16细胞用808 nm激光(2 W/cm2)照射5 min，细胞存活率显著下降。动物实验表明，在激光照射条件下，卵清蛋白-ICG纳米疫苗能明显抑制移植瘤生长，而且瘤内注射的纳米疫苗可以渗透到瘤周区域，促进免疫活性树突状细胞的成熟，并诱导免疫应答。因此，卵清蛋白-ICG纳米疫苗不仅能够实现强大的光热和免疫治疗效果，还可以作为纳米疫苗用于肿瘤预防。另外，有效的树突状细胞标记/刺激赋予了卵清蛋白-ICG纳米疫苗在激活树突状细胞体内追踪方面的巨大潜力，为多功能治疗性纳米疫苗的制备提供了一种潜在有效的方法。Chen等[19]采用乳液法将可生物降解聚合物聚乳酸-羟基乙酸[poly(lactic-co-glycolic)acid，PLGA]包埋在近红外染料ICG和咪喹莫特(imiquimod，R837)上得到了纳米粒子PLGA-ICG-R837。其中，PLGA作为载体，ICG作为荧光成像探针和光热剂，用于生物显像协助诊断及光热抗肿瘤治疗；R837作为一种有效的Toll样受体7激动剂，用于激活免疫反应。体外实验证实，PLGA-ICG-R837光热消融4T1乳腺癌细胞后的残留物可以显著促进树突状细胞的成熟。进一步的动物实验显示，基于PLGA-ICG-R837的光热疗法能够在体内诱导免疫刺激效应消融肿瘤细胞，这种含有R837的纳米颗粒与肿瘤消融治疗后释放的肿瘤相关抗原相结合，在体内显示出疫苗样的功能，可能诱导受体产生主动免疫。在抗细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4检查点阻断治疗的辅助下，基于PLGA-ICG-R837介导的光热疗法能产生强烈的免疫应答，抑制免疫抑制调节性T细胞的活性，攻击小鼠体内残留的肿瘤细胞。因此，光热疗法与免疫治疗的协同作用可能具备潜在抑制肿瘤生长、转移和复发的能力，且不良反应少，为针对特定肿瘤治疗的临床应用提供了可能。

2.3光热疗法协同化疗 目前化疗仍是肿瘤学研究领域最常用的治疗手段之一。然而在实际临床工作中化疗仍存在多药耐药、胃肠道不良反应等问题。光热疗法是一种外部刺激，可以通过引起光热材料结构变化、热响应化学键的断裂等触发药物靶向释放。此外，还可以通过调节温度及近红外光强度来调控药物释放速率[28]。Li等[29]开发了一种由ICG和表柔比星简单混合在水溶液中组装成的小分子纳米颗粒ICG-表柔比星，用于近红外荧光和光声双模式成像引导的光热疗法协同化疗。ICG-表柔比星纳米粒子在水中稳定性好，并具有较好的光热响应性、近红外荧光和光声成像性能及良好的释药特性。ICG-表柔比星纳米粒子具有良好的肿瘤靶向能力，同时也降低了药物对血液循环系统中正常细胞的毒性。在体外实验中，与单一化疗或光热疗法相比，经ICG-表柔比星纳米粒子联合激光处理的4T1乳腺癌细胞的总凋亡率高达95.4%，明显高于任何单一处理组。动物实验显示，采用ICG-表柔比星纳米粒子+激光照射处理的实验组中移植瘤几乎被清除且无复发，肿瘤生长抑制率显著。综上所述，这种治疗剂与显像剂的协同组合可用于设计高效的一体式纳米热疗体系，用于靶向成像引导的光热疗法协同化疗。Gao等[30]合成了一种新型的由阿霉素(doxorubicin，Dox)、ICG和D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯[D-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate，TPGS(简称T)]在室温下利用自组装技术按照一定比例制备而成的多功能T/Dox-ICG纳米粒子。体外细胞实验显示，T/Dox-ICG纳米粒子为影像引导的光热疗法联合化疗提供了新的载体，并进一步克服了P-糖蛋白介导的肿瘤多药耐药。激光作用下的T/Dox-ICG纳米粒子组对多药耐药细胞的杀伤作用明显高于单一T/Dox-ICG纳米粒子、ICG、Dox、Dox-ICG组及ICG+激光组，细胞存活率仅为8.75%，有望为未来的成像引导肿瘤联合治疗提供有力支持。因此，同时负载ICG和化疗药物的纳米颗粒在用于实时监测细胞内药物输送和靶向多模式成像引导的光热疗法协同化疗方面显示出巨大的潜力。

2.4光热疗法协同基因治疗 随着肿瘤细胞高度特异、高效、低毒副作用的肿瘤治疗新策略的发展，基因治疗与光热疗法的协同疗法已成为一种有前途的治疗策略，相关研究证明基因治疗联合光热疗法能够产生协同的抗肿瘤效果[31]。

Zheng等[20]利用介孔二氧化硅纳米球(mesoporous silica，MSiO2)、氧化钨纳米晶(W18O49，WO)、ICG和Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)基因成功构建了一种新型的纳米复合材料(WO+ICG)@mSiO2@DOTAP@Bax，用于近红外荧光引导的基因治疗和光热疗法。在该纳介米平台中，MSiO2是一个有效载体，可保护有效载荷不受恶劣环境的影响；Bax是一种强烈的促凋亡基因，能诱导肿瘤细胞凋亡；ICG可用于视觉治疗中的荧光成像；而WO在近红外光照射下会产生局部过热，能引发明显的肿瘤坏死。体外实验表明，接受(WO+ICG)@mSiO2@DOTAP@Bax和808 nm近红外激光照射的B16肿瘤细胞均被杀死。动物体内实验表明，在808 nm的近红外光照射下，这种新颖的多功能纳米系统在体内具有显著的实体瘤抑制效率。因此，该基因治疗联合光热疗法的纳米平台具有显著的协同抗肿瘤活性，在临床试验中具有潜在的应用前景。Tang等[32]设计并构建了脂质包裹的磷酸钙(lipid-coated calcium phosphate，LCP)纳米粒子，然后将细胞死亡(cell death，CD)基因和ICG共负载到LCP纳米粒子中，再用双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb)偶联LCP纳米粒子最终得到了LCP-CD/ICG-BsAb纳米粒子，其作为基因治疗联合光热疗法的有效靶向递送系统，在体内外能抑制三阴性乳腺癌的生长。LCP纳米粒子可显著提高ICG的光稳定性及靶向成像能力，有效促进乳腺癌细胞对CD-干扰小RNA和ICG的摄取，而BsAb的存在可进一步增强载药药物在肿瘤组织中的蓄积和渗透，显著抑制乳腺癌细胞的生长。动物体内实验表明，在温和条件下使用靶向LCP-CD/ICG-BsAb纳米粒子联合光热疗法治疗后，小鼠模型中的乳腺肿瘤几乎被杀灭。因此，LCP-CD/ICG-BsAb纳米粒子+激光辐射的联合治疗可能是一种新型的靶向基因/光热癌症治疗策略。

2.5光热疗法协同光动力疗法和免疫治疗 光动力疗法协同光热疗法可以消除部分原发性肿瘤，但不能抑制肿瘤的广泛转移和局部复发；协同免疫疗法在诱导全身免疫并有效抑制肿瘤复发和转移方面显示出巨大的潜力[33]。

Fan等[34]以特定的金属-有机骨架(metal-organic framework，MOF)为核心载体，采用ICG和免疫佐剂胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤序列(cytosine-phosphate-guanine sequence,CpG)双重修饰，构建了一种多模式成像引导的名为ICG-CpG@MOF的肿瘤协同光免疫治疗系统。该纳米体系可以被动地定位于肿瘤部位，实现肿瘤的荧光、光声及磁共振成像。ICG-CpG@MOF可促进谷胱甘肽控制的免疫佐剂释放到肿瘤微环境中。此外，与CpG共同释放的肿瘤相关抗原可以激活免疫系统，显著增强肿瘤的细胞毒性，以最小的不良反应获得高治愈率。体外实验表明，ICG-CpG@MOF联合激光照射可诱发70%的肿瘤细胞凋亡，与对照组(只含4T1细胞和培养基且不接受治疗)相比差异有统计学意义(P<0.01)。在4T1乳腺癌的小鼠实验模型中，与空白组相比，在激光作用下，ICG-CpG@MOF组小鼠经过21 d治疗后肿瘤基本消失且存活时间相对较长。另外，利用4T1乳腺癌细胞建立的乳腺癌肺转移模型显示，尾静脉注射104个细胞至模型鼠体内后的第21天，对照组(不接受治疗的乳腺癌肺转移模型小鼠)癌细胞浸润至全肺组织，而治疗组癌细胞浸润受到明显抑制。因此，这种利用多模式成像和光免疫协同抗肿瘤的策略在肿瘤诊疗方面具有广阔的应用前景。Liang等[35]提出了一个多功能成像引导治疗的创新纳米平台金纳米星(gold nanostars，GNS)@ICG-抗体(antibody，Ab)-细胞因子诱导的杀伤(cytokine-induced killer，CIK)，它将荧光、光声及CT三模成像和光热疗法、光动力疗法和免疫三模治疗结合到了一个纳米结构中，实现了肿瘤的高效治疗。该平台以高表面积体积比的GNS为基础，极大地提高了与ICG和抗体的附着性，并能引导光声和CT成像，同时担负着光热转化作用。修饰后的ICG具有更高的体内稳定性，为光动力疗法提供了近红外荧光成像和氧的转化。曲妥珠单抗的偶联不仅提高了GNS@ICG-Ab-CIK中CIK细胞的负载率，而且有助于该纳米平台与人类表皮生长因子受体2阳性细胞的选择性结合，进而激活免疫应答。体外实验显示，经808 nm激光照射后，GNS@ICG-Ab-CIK处理组SK-BR-3细胞死亡最多；动物体内实验表明，用808 nm激光照射，GNS@ICG-Ab-CIK组小鼠生存期延长，肿瘤体积缩小，治疗效果优于空白组和ICG组。综上所述，三模态成像与三模态治疗的结合赋予了ICG纳米体系在癌症治疗中的巨大潜力，并为免疫细胞在纳米医学递送中的应用奠定了基础。

2.6光热疗法协同光动力疗法和化疗 化疗、光热疗法和光动力疗法三种治疗方法的联合应用在克服肿瘤多药耐药、不良反应及提高抗肿瘤疗效方面具有极大潜能[36]。

Wang等[37]开发了一种名为人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)-ICG-顺铂纳米粒子的新型靶向药物释放系统，由HSA包裹ICG-顺铂组成。HSA-ICG-顺铂纳米粒子不仅可以作为光动力疗法和光热疗法试剂，还能作为肿瘤显像探针划定肿瘤和正常组织的分界线并指导肿瘤切除。ICG的近红外光热效应能导致ICG-顺铂的配位键断裂，在808 nm的近红外辐射下，肿瘤组织中顺铂的释放可以被精确触发，因此能确保药物在肿瘤细胞和肿瘤相关成纤维细胞中的定位给药/释放，降低化疗的全身毒性。体内治疗时，静脉注射HSA-ICG-顺铂纳米粒子至携带HSC-异种移植肿瘤的小鼠模型后，HSA-ICG-顺铂纳米粒子在肿瘤组织内积聚，显示出较ICG、HSA-ICG和顺铂更强的抗肿瘤作用，移植瘤的生长完全被抑制。总之，这种新型的近红外触发药物释放系统通过光热疗法、光动力疗法及化疗的协同作用显示出改善口腔鳞状细胞癌治疗的潜力。Dai等[38]通过将ICG、抗肿瘤药物Dox和共轭钆、叶酸封装到热敏脂质体(temperaturesensitive liposome，TSL)中成功地制备了ID@TSL-共轭钆纳米粒子，可用于荧光、光声及磁共振三模式成像引导的光热疗法、光动力疗法和化疗。通过荧光、光声及磁共振三模式成像可以显示该纳米材料和肿瘤在体内的生物分布，清晰地定位肿瘤，协助进一步的影像引导下的肿瘤治疗。近红外激光照射可以控制Dox从该纳米材料中持续释放。通过尾静脉注射ID@TSL-共轭钆纳米粒子至小鼠肿瘤模型后，其可在模型小鼠皮下HeLa移植瘤中有效积聚，精确的影像引导近红外触发的光疗协同化疗可有效地抑制肿瘤生长，与磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液+激光、ID@TSL-共轭钆纳米粒子和ICG@TSL-共轭钆纳米粒子+激光治疗相比，激光照射后用ID@TLS-共轭钆纳米粒子治疗的小鼠肿瘤体积最小。因此，上述研究为影像导向的肿瘤协同治疗的多功能纳米粒子的开发提供了新平台。

3 小 结

光热疗法与光动力疗法、免疫治疗、基因治疗及化疗的联合应用为肿瘤的有效诊疗提供了新思路，代表了一种适合临床的新型治疗方法。同时，构建诊疗一体化的ICG纳米光热体系，也极大地改善了ICG的稳定性。尽管光热疗法联合抗肿瘤的治疗方法被广泛研究，但目前仍处于探索阶段，仍有许多不足之处需要改进。首先，必须考虑到光热材料的稳定性、降解性、组织毒性，不同联合模式下对具体肿瘤的适用性。另外，还应进一步解决光热疗法协同免疫治疗诱导的免疫反应的强度和可控性。随着人们对肿瘤诊断水平和治疗效果提出了更高的期待，发展整合肿瘤标记示踪、载体靶向运输及早癌诊疗等功能于一体的纳米探针成为未来的研究重点。