慢性移植物抗宿主病相关干眼纤维化发病机制研究进展△

方鸿平 张 琪

慢性移植物抗宿主病(cGVHD)是供体的免疫系统将受体组织识别为外来组织而引起的一系列临床表现，可能的发病机制包括中枢和外周耐受缺失、细胞因子紊乱和自身抗体产生异常等[1]。异基因造血干细胞移植后约一半的患者发生眼部cGVHD，而干眼为眼部cGVHD标志性表现，cGVHD相关干眼患者常具有睑板腺萎缩、结膜瘢痕、泪小点自发性闭塞和睑球粘连等特征表现[2]。研究发现，cGVHD相关干眼患者泪腺[3]、睑板腺[4]、结膜[5]、眼睑等组织的主要病理生理表现为慢性炎症和过度纤维化，是cGVHD相关干眼患者所特有的，在中重度干眼患者中均未发现[6]。此外，cGVHD相关干眼患者早期即可出现纤维化改变，导致干眼快速进展，甚至失明，且对当前临床常规治疗反应差。目前，该病的发病机制尚不清楚，针对cGVHD相关干眼纤维化的诊断方式缺乏，也没有有效的治疗方法和预防策略。本文从成纤维细胞、免疫细胞、促纤维化细胞因子、肾素-血管紧张素系统、内质网应激方面论述cGVHD相关干眼纤维化发病机制的研究进展，为深入研究cGVHD相关干眼纤维化发病机制提供参考，并且为研发新的诊断、治疗和预防策略提供方向。

1 成纤维细胞与纤维化

1.1 成纤维细胞成纤维细胞是cGVHD相关干眼患者受累器官纤维化的主要效应细胞，它不仅可分泌细胞外基质介导纤维化，还可作为抗原提呈细胞介导细胞免疫，在泪腺、结膜、睑板腺、眼睑中浸润明显增加。Ogawa等[3]发现，cGVHD干眼患者泪腺导管区CD34+成纤维细胞明显增多，与导管区纤维化程度正相关，这些成纤维细胞被各种免疫细胞、促纤维化细胞因子、肾素-血管紧张素系统、内质网应激等因素激活后，具有良好的粗面内质网，可分泌大量细胞外基质。最近，在cGVHD小鼠泪腺中发现这些活化的成纤维细胞呈纺锤状，功能上具有显著的增殖能力、侵袭能力和迁移能力[7]。Ogawa等[8]通过免疫组织化学进一步研究发现泪腺区活化的成纤维细胞高表达HSP47，低表达α-SMA。HSP47是一种胶原合成分子伴侣蛋白，与纤维化呈正相关，低表达α-SMA可能是cGVHD患者泪腺特有的，表明其不能转化为肌成纤维细胞，而在结膜和睑板腺等其他组织中，成纤维细胞常转化为高度活跃的肌成纤维细胞。Yamakawa等[9]观察到cGVHD小鼠滴用含HSP47 siRNA的维生素A偶联脂质体(一种HSP47拮抗剂)后，成纤维细胞中HSP47表达受到抑制，泪腺纤维化和干眼症状均减轻，因此抑制成纤维细胞活化或抑制HSP47表达可能是控制纤维化进展的一个方向。目前研究主要集中在泪腺周围导管区成纤维细胞上，其活化的机制仍不明确，但成纤维细胞是控制纤维化进展的关键点，可能是未来研究的方向之一。

1.2 成纤维细胞来源明确成纤维细胞的来源和作用方式对深入研究cGVHD相关干眼纤维化机制及诊疗方式的研发同样重要，研究发现,cGVHD相关干眼患者泪腺、睑板腺和结膜成纤维细胞呈嵌合状态，主要有供体来源和受体上皮细胞经上皮间充质转化而来[10-11]。

1.2.1 供体来源化疗、预处理方案、急性移植物抗宿主病(aGVHD)等均可导致组织损伤，促使供体来源的循环干细胞或前体细胞归巢，并在局部组织微环境影响下分化。Ogawa等[10]发现，导致cGVHD患者泪腺纤维化区的成纤维细胞将近一半来源于移植供体细胞。Hallberg等[11]在异基因造血干细胞移植术后患者的结膜印迹样本中检测到供体来源的肌成纤维细胞，虽然比例较小，但随时间逐渐增多。最近对cGVHD小鼠的研究表明，泪腺、腮腺、皮肤等纤维化组织中约一半的HSP47+成纤维细胞来源于供体骨髓间充质干细胞，而不是造血干细胞[12-13]。虽然这些供体细胞的确切来源和分化过程尚不清楚，但是抑制成纤维细胞前体募集到受损组织以及选择耗尽供体骨髓间充质干细胞的造血干细胞移植可作为降低cGVHD相关干眼纤维化的方法。

1.2.2 上皮间充质转化上皮间充质转化(EMT)是指不同类型的上皮细胞在不同因素的影响下，通过一系列的生物学变化，转化为间充质细胞的过程。Ogawa等[14]研究发现，cGVHD患者结膜基底上皮和泪腺肌上皮常被allo-HSCT后移行的炎症细胞和细胞因子激活并获得了间充质表型，分泌大量的异常胶原束，这表明，EMT可能参与黏膜和外分泌腺的纤维化改变。而基底膜的破坏、细胞外基质和细胞胞浆之间的相互作用可能参与cGVHD的EMT发病机制，上皮基底膜在MMP9和IV型胶原酶作用下被破坏，上皮细胞极性因基底膜的破坏而丧失，继而上皮细胞肌动蛋白细胞骨架的分布改变；另外细胞外基质中的I型胶原束可下调上皮细胞间的E-钙黏蛋白，促进细胞核从细胞间位置向细胞核位置移动等来触发EMT。EMT是一个动态过程，触发因素多样，研究困难，但充分了解不同触发因素在结膜和泪腺cGVHD纤维化中的作用，将有助于阐明EMT的发病机制，从而有助于针对EMT过程研发相关诊断和治疗策略，阻碍cGVHD相关干眼纤维化进展。

2 免疫细胞与纤维化

各种免疫细胞在cGVHD相关干眼慢性炎症和纤维化中起关键作用，各种免疫细胞间及其与成纤维细胞间通过原始接触互相促进，其机制复杂，但对它们的深入研究有助于靶向各种免疫细胞的治疗方案研发。

2.1 T细胞供体来源的同种异体反应性T细胞和自身反应性T细胞为cGVHD相关干眼纤维化区浸润的主要免疫细胞[15]，Th1细胞、Th2细胞和Th17细胞均参与其中，在慢性炎症和纤维化中起关键作用。Tatematsu等[16]通过对cGVHD患者结膜活检发现大量CD8+T细胞通过破坏的基底膜在基底细胞间浸润，Giannaccare等[17]在cGVHD小鼠中发现结膜基质纤维化区CD4+T和CD8+T细胞数量增多，而Treg细胞减少。Ogawa等[18]研究表明，cGVHD干眼患者中异常T细胞通过破裂的血管基底膜迁移到泪腺和睑板腺[4]组织，在导管周围区识别APCs提呈的抗原肽后活化。一方面，活化的CD4+T细胞直接与成纤维细胞作用或通过分泌白细胞介素4(IL-4)、IL-6和IL-17等可溶性成纤维细胞因子使成纤维细胞增殖活化；另一方面，CD8+T细胞直接与抗原识别或在CD4+T辅助细胞作用下活化，通过破裂的基底膜侵入并破坏导管上皮，导致导管闭塞，引起继发性纤维化[2]。因此，抑制异常CD4+T和 CD8+T细胞活化及其相关通路的激活，可能是阻碍纤维化的一个方向。此外，最近有研究表明，Th17细胞和Treg细胞的失衡也参与了cGVHD，提示进一步研究T细胞各类亚群的作用，将有助于研发更具针对性的诊治策略。

2.2 巨噬细胞目前，有研究已证实，巨噬细胞参与cGVHD皮肤和肺纤维化[19]。巨噬细胞在T细胞及其细胞因子作用下激活与分化，活化的巨噬细胞一方面通过分泌TGF-β、PDGF、IL-6等纤维化细胞因子介导成纤维细胞的募集、活化及向肌成纤维细胞转化；另一方面，通过调节T细胞活化和分化，诱导B细胞产生自身抗体来介导纤维化[20]。传统上将巨噬细胞分为M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞，M2型巨噬细胞表达CD163。Inamoto等[21]发现cGVHD中主要为M2型巨噬细胞，M2型巨噬细胞为促纤维化亚型，能够召集成纤维细胞并促进其活化，因此，针对M2型巨噬细胞受体，如CD163及其介导纤维化的清道夫受体MARCO的靶向治疗可能对抑制纤维化有效。研究发现，cGVHD相关干眼患者泪腺导管区、结膜上皮和基质中的巨噬细胞较无干眼患者明显增多[16]，但目前关于巨噬细胞对cGVHD相关干眼纤维化的作用研究很少，鉴于最近巨噬细胞在皮肤和肺纤维化的重要作用，深入研究巨噬细胞在cGVHD相关干眼纤维化中的作用将具有重要意义。

2.3 B细胞B细胞在cGVHD发病机制中起潜在的关键作用，70%cGVHD患者血清中自身抗体水平升高[22]。以往研究发现，cGVHD患者外周血中存在异常的供体B细胞亚群和高水平的B细胞活化因子，B细胞活化因子可维持异常B细胞的形成与活化[23-24]，并促进B细胞抗原受体信号和Notch2信号通路显著激活[25]，导致异常B细胞在滤泡外和生发中心持续激活、增殖，产生大量自身抗体[26-27]。Svegliati等[28]在皮肤或肺纤维化的cGVHD患者中检测到较高水平的血小板源性生长因子受体(PDGFR)自身抗体，与纤维化程度密切相关。这些自身抗体通过识别成纤维细胞上的PDGFR，并通过Ha-Ras-ERK 1/2-ROS信号通路刺激I型胶原α1和α2基因表达，促进胶原的生成，还可诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转化。虽然在cGVHD干眼患者泪腺和结膜活检标本中仅观察到少量B细胞和浆细胞[3, 29]，也无相关研究对其抗体进行检测和分析，但这是未来研究的一个方向，当靶向其他免疫细胞无效时，针对B细胞受体及其抗体相关信号通路的靶向治疗将是控制纤维化的较好选择。

2.4 中性粒细胞中性粒细胞的作用常在aGVHD中被描述，最近在cGVHD中也被描述，其分泌的中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)能以TGF-β非依赖性方式诱导成纤维细胞增殖和向肌成纤维细胞转化。Arafat等[30]通过检测14例cGVHD相关干眼患者泪液发现，NE水平显著增加，而Byun等[31]使用结膜印迹细胞学观察到76例cGVHD相关干眼患者上睑结膜中性粒细胞数量显著增加，且与角膜染色评分，泪液中NE和髓过氧化物酶水平呈中度相关，这表明，中性粒细胞及其相关蛋白极有可能参与cGVHD相关干眼的结膜和睑板腺纤维化过程，但还需更多的基础研究加以证实。An等[32]进一步研究表明，中性粒细胞分泌的胞外杀菌网络(NET) 可以促进成纤维细胞增殖、肌成纤维细胞转化和胶原收缩；此外，NET相关蛋白NGAL可促进EMT，LIGHT/TNFSF14可促进供体T细胞的活化增殖。该研究还发现，模型小鼠在滴用亚抗凝剂量的肝素(10 000 U·L-1)后，NET被分解，眼表炎症、结膜瘢痕和睑板腺萎缩明显减轻，这表明，NET相关蛋白具有作为纤维化生物标记物的潜在价值，解除NET和NET相关蛋白特异性抑制剂可能具有抑制纤维化的潜力。

2.5 肥大细胞研究证明，肥大细胞参与了人类和小鼠cGVHD。活化的肥大细胞可脱颗粒产生大量成纤维细胞生长因子，诱导成纤维细胞增殖与活化，最终导致整个受影响器官系统的致病性纤维化[33]。但目前关于肥大细胞在cGVHD的研究还处于初步阶段，是否参与cGVHD相关干眼的纤维化及其作用方式等均不清楚，但为下一步研究提供了一个方向。

3 促纤维化细胞因子

多个研究发现，cGVHD相关干眼患者外周血清、泪液、泪腺和结膜中细胞间黏附分子-1、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-13、IL-17A、结缔组织生长因子(CTGF)、TGF-β、血小板源性生长因子(PDGF)等细胞因子升高，在cGVHD发病中起重要作用[34-36]，部分参与纤维化作用。研究证实，TGF-β在cGVHD患者皮肤、肺和肝纤维化中起重要作用[37]，主要由巨噬细胞产生，作用于成纤维细胞TGF-β受体，通过下游Smad3蛋白传导信号，刺激胶原蛋白的基因转录，促进胶原合成；也可促进IL-11、CTGF、PDGF等纤维化效应因子的产生来增强纤维化；此外，TGF-β还可促进EMT过程，介导肌成纤维细胞的转化[38-40]。Ogawa等[41]发现8例cGVHD相关干眼患者局部滴用曲尼司特(一种TGF-β抑制剂)后症状较对照组显著改善，表明TGF-β及其相关通路抑制剂具有控制cGVHD相关干眼纤维化的应用前景。研究表明，IL-6参与cGVHD皮肤纤维化[42]，可通过激活成纤维细胞JAK/STAT3和MAPK/ERK信号通路诱导胶原产生，促进纤维化[43]；此外，Yamane等[35]研究发现，IL-6作为衰老相关分泌表型的主要驱动因子，也可通过诱导巨噬细胞、T细胞和成纤维细胞衰老促进纤维化，并观察到模型小鼠在使用IL-6拮抗剂MR16-1后泪腺纤维化减轻，推测IL-6拮抗剂在抑制cGVHD相关干眼纤维化中也具有应用前景。IL-17A也被证实参与cGVHD患者皮肤、肝和肺纤维化，可能直接作用于成纤维细胞使其活化、增殖和分化，趋化中性粒细胞和巨噬细胞等浸润并刺激下游促纤维化因子产生而引起纤维化改变[44]，而在眼部纤维化过程中IL-17A极有可能具有相似作用，但需进一步研究证实。

4 肾素-血管紧张素系统与纤维化

许多外周组织能够产生肾素-血管紧张素系统(RAS)成分，称为组织RAS，cGVHD小鼠泪腺中也存在组织RAS[45]，Ang II是RAS的主要效应肽，已被确定为纤维化的重要调节因子[46]，可通过诱导NADPH氧化酶活化，刺激TGF-β1的产生并直接触发成纤维细胞增殖、分化来发挥作用。Yaguchi等[47-48]通过免疫组织化学检测发现，cGVHD小鼠泪腺纤维化区存在大量高表达HSP47、Ang II、AT1R和AT2R的成纤维细胞，这提示，RAS系统可能在泪腺纤维化区域被激活。此外，还发现小鼠在使用AT1R拮抗剂后泪腺炎症细胞浸润和纤维化受到抑制，而使用AT2R拮抗剂后泪腺炎症细胞浸润及纤维化并没有受到抑制，这表明组织RAS诱导的纤维化可能是通过AT1R介导，其机制可能为降低了成纤维细胞中HSP47和胶原的表达或抑制了高表达HSP47和胶原的成纤维细胞数量来改善纤维化，但需要进一步研究明确其机制以及cGVHD如何影响RAS成分的表达。而AT1R拮抗剂可能是抗纤维化治疗的一种有效策略。

5 内质网应激与纤维化

内质网(ER)是蛋白质形成、成熟的地方，若内质网功能失衡，错误折叠或未折叠蛋白异常聚积，继而触发内质网应激，随后启动未折叠蛋白反应，如果未折叠蛋白反应不成功，炎症和凋亡途径被激活，导致促炎分子硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)、活化B细胞转录因子核因子κ轻链增强子(NF-κB)和凋亡蛋白C/EBP同源蛋白表达[49]。Mukai等[50]研究表明，cGVHD小鼠泪腺可能受到氧化应激的损伤，继而ER应激水平升高，特别是上皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞中的ER应激明显活化。cGVHD小鼠泪腺中成纤维细胞ER应激活化后以一种有害的方式激活成纤维细胞，诱导HSP47和CTGF蛋白过表达，而巨噬细胞ER应激活化后被诱导分化为促纤维化亚型M2型。ER应激相关的促炎分子和TXNIP的表达和活性以失控的方式增加，诱导广泛的炎症。还有研究表明，TXNIP与EMT相关[51]，促进纤维化，该研究还发现，在使用ER应激抑制剂苯基丁酸后，小鼠系统性纤维化明显减轻，提示抑制ER应激的活化也可能是治疗cGVHD相关干眼的一个新方向。此外，ER应激是否参与眼部其他组织如结膜和睑板腺的纤维化及其作用方式需进一步研究。

6 小结与展望

纤维化与cGVHD相关干眼发生发展密切相关，一旦发生很难逆转，因此早期识别与治疗显得尤为重要。该病发病机制复杂，成纤维细胞、免疫细胞、细胞因子、RAS系统和ER应激均参与了这一过程。虽然目前关于cGVHD相关干眼纤维化机制的大部分研究主要在泪腺和结膜，并且都处于实验室阶段或初步阶段，但是具有研究价值，随着研究的不断深入，能针对cGVHD相关干眼纤维化研发出有效的诊断、治疗和预防策略，这将是cGVHD相关干眼患者的巨大福音。