猪流行性腹泻病毒X-6/2021株的分离鉴定及其S1基因序列分析

张丽燕，邱文英，陈奕帆，李 倩，汤笑语，罗文泽，胥燕芳

（1.华派生物工程集团有限公司，四川 成都 641402；2.西南民族大学，四川 成都 610041）

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）引起的一种急性、高度接触性胃肠道传染病，该病的主要临床症状为严重腹泻、脱水以及迅速消瘦，最终因严重脱水而死亡[1]。中国于1979年发现PEDV，一直呈散发状态。自2012年10月呈大规模流行趋势，该病对哺乳仔猪的危害最为严重，感染后死亡率高达100%，对养猪业造成重大经济损失[2-3]。此病毒在发现10年之后，Hofmann等[4]用在Vero细胞中添加胰酶的方式终于成功培养。本试验将猪流行性腹泻病毒疑似病料处理后，接种Vero细胞以分离病毒[5-8]，通过RT-PCR特异性片段的检测、典型病变的观察和间接免疫荧光（IFA）试验，鉴定所分离到的毒株为PEDV，并对S1基因进行遗传进化分析。PEDV在细胞上的成功分离及S1基因的遗传进化分析，为以后生物学、疫苗开发等研究提供了基础。

1 发病情况和临床症状

四川某猪场有存栏母猪1 000头左右，2020年10月，初生7日龄内仔猪陆续出现腹泻不止，排淡黄色水样稀便，脱水严重且死亡率较高。选取腹泻症状较明显的仔猪进行剖检发现，仔猪肠壁充气、变薄、充血（图1），肠绒毛脱落明显，肠道中含有未消化的乳凝块。

图1 病猪剖检后的肠道

2 材料与方法

2.1 细胞与主要试剂

非洲绿猴肾细胞（Vero）由华派生物工程集团有限公司质管部保存；鼠抗PEDV全病毒阳性血清由华派生物工程集团有限公司研发中心制备并保存。

FITC-羊抗鼠IgG购自KPL公司；TRIzol™ LS Reagent购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；高效率逆转录试剂盒购自东洋纺（上海）生物科技有限公司；DMEM培养基、胰酶购自GIBCO；新生牛血清购自内蒙古金源康生物工程材料有限公司。

2.2 引物的设计与合成

根据从GenBank数据库下载的PEDV S1基因序列，应用MegAlign软件分析出序列中较保守区域。使用Primer Primier 5.0软件按照引物设计原则，设计合成1对扩增PEDV的检测引物，设计3对可覆盖S1基因全长的特异性引物，TGEV（猪传染性胃肠炎病毒）、PRoV（猪轮状病毒）、PDCoV（猪德尔塔冠状病毒）检测引物均由华派生物工程集团有限公司研发中心保存，引物序列见表1，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物序列

2.3 临床样本中PEDV的检测

参照TRIzol™ LS Reagent试剂说明书提取病毒的基因组RNA，以提取的总RNA为模板，利用cDNA反转录试剂盒合成病毒cDNA。以cDNA为模板，配制PCR扩增体系：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 3 μL，ddH2O 7.5 μL。反应程序为95 ℃，5 min；95 ℃，45 s；55 ℃，30 s；72 ℃，1 min；30个循环；72 ℃，10 min。反应结束后，使用1%琼脂糖凝胶进行鉴定，对符合预期目的条带的PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

2.4 病料的处理及PEDV的分离培养

2.4.1 PEDV阳性病料处理 取RT-PCR鉴定为PEDV单一阳性的小肠组织，加入灭菌的PBS缓冲液研磨，制成20%（1∶5的重量体积比）组织悬液，反复冻融3次后离心收集上清液，上清液用0.22 μm滤器过滤除菌。将过滤除菌后组织液进行分装，一部分用于接下来的分离鉴定，剩下的保存于-70 ℃冰箱中保存备用。

2.4.2 PEDV病毒的分离与传代培养 取长满单层的Vero细胞（T75细胞瓶），弃去生长液，用PBS洗涤3次后，加入过滤的上清液2.0 mL（含10 μg/mL胰酶），置37 ℃吸附作用1 h后弃掉多余液体，加入含10 μg/mL胰酶的MEM，置37 ℃培养箱进行培养，同时设置空白对照组。之后逐日观察细胞是否出现病变，无病变则在培养72 h左右收获；连续进行盲传，直到出现明显且稳定的细胞病变。在第5代时进行RT-PCR鉴定。

2.5 TCID50（半数组织培养感染剂量）的测定

将第8代细胞毒进行10-1～10-6的10倍系列稀释，每个稀释度重复8孔，分别接种于Vero细胞，同时设置Vero细胞做阴性对照，连续培养3～5 d，统计出现CPE孔数，按照Reed-Muench法计算细胞毒的TCID50。

2.6 PEDV分离株的间接免疫荧光鉴定（IFA）

将Vero细胞接种于24孔板中，待细胞长到80%左右，将分离的病毒接种于Vero细胞，同时设定正常细胞作为阴性对照。接毒24 h后弃去上清液，用冷却的多聚甲醛固定液固定40 min，之后加入5%脱脂乳封闭2 h。以1∶1 000鼠抗PEDV全病毒阳性血清为一抗、以1∶200稀释的FITC-羊抗鼠IgG为二抗，进行IFA鉴定。

2.7 PEDV分离株S1基因扩增

以F8代细胞培养物cDNA为模板，通过引物PEDV-S1-1/S1-2/S1-3对分离株S1片段进行RTPCR扩增，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，对符合预期目的条带的PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

2.8 S1基因序列变异情况分析

根据序列测定结果，利用DNAStar软件将S1-1～S1-3片段拼接成完整的S1基因，将所获得的S1基因序列提交到NCBI进行比对分析，选出有代表性的PEDV参考毒株的S1基因序列（表2），运用DNAStar、MEGA等软件进行分析比较，构建基因系统进化树。

表2 PEDV参考毒株及其序列信息

3 结果与分析

3.1 病毒的分离与培养

利用实验室已有的PEDV、TGEV、PRoV、PDCoV特异性引物对该腹泻仔猪病料进行RT-PCR检测，检出该样品单一感染PEDV（图2）。在Vero细胞上盲传至第3代，细胞出现PEDV经典的CPE。在传至第8代后，病变稳定，主要表现为：细胞融合，形成葡萄串珠状（图3）。将F5代病毒液进行RT-PCR鉴定，扩增出一条约700 bp的特异性目的条带（图4），表明试验成功从病料中分离到1株PEDV。

图2 RT-PCR扩增结果

图3 Vero细胞感染病毒产生的细胞病变

图4 RT-PCR鉴定结果

3.2 TCID50的测定

将PEDV分离株连续传代，并将第8代细胞毒接种于Vero细胞，连续培养3 d后，统计出现CPE孔数，按照Reed-Muench法计算第8代细胞毒的TCID50为10-4.5/0.1 mL。

3.3 PEDV分离株的间接免疫荧光鉴定

将分离的猪流行性腹泻病毒（PEDV）毒株接种于Vero细胞，利用IFA方法对病毒感染的Vero细胞进行间接免疫荧光鉴定，未接毒的正常Vero细胞作为阴性对照。结果表明，PEDV分离株感染细胞后可与PEDV鼠源全病毒血清发生特异性结合，出现特异性免疫荧光，而对照组没有出现荧光（图5）。

图5 X-6/2021株感染Vero细胞的间接免疫荧光鉴定

3.4 PEDV分离株S1基因的扩增及序列测定

3对引物扩增示意图见图6，PEDV-S1-1→PEDV-S1-3。对分离的PEDV X-6/2021株S1-1/S1-2/S1-3基因片段进行RT-PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶鉴定，结果显示，出现与预期片段大小相符的条带（图7），将PCR产物进行测序。

图6 PEDV-S1-1/2/3引物扩增示意

图7 引物PEDV-S1-1/2/3扩增产物电泳结果

3.5 S1基因序列变异情况分析

根据序列测定结果，利用DNAStar软件将S1-1～S1-3片段拼接成完整的S1基因，将所获得的S1基因序列提交到NCBI进行比对分析，选出有代表性的PEDV参考毒株的S1基因序列（表2），运用DNAStar、MEGA等软件进行分析比较，构建基因系统进化树，对参考序列与目标序列进行核苷酸相似性比对及绘制进化树（图8）。

图8 S1基因序列构建的基因进化树

由进化树结果可得到，所有PEDV毒株根据S1基因序列分为2大组即Ⅰ型和Ⅱ型。PEDV-X-6/2021毒株与Ⅰ型参考毒株的同源性为90.6%～93.2%，与Ⅱ型参考毒株的同源性为97.6%～99.0%，验证了我们此次试验分离的毒株为PEDV流行毒株。

4 结论与讨论

PEDV首次在欧洲被报道[2]，产生与猪传染性胃肠炎相似的临床症状[9]。但近年在亚洲和北美的流行对养猪业造成的经济损失远大于欧洲。亚洲如泰国、韩国、日本、越南与中国等国家[10-13]，因近年PEDV的流行，给养猪业造成了严重的经济损失。感染仔猪主要表现呕吐腹泻，肠道剖检发现肿大透明，内有未消化的乳凝块，最终严重脱水而死，死亡率较高可达100%[2-4，10，14]。

虽然疫苗在PED的防控中发挥了重要的作用，但是越来越多的猪场在使用PEDV疫苗后PED仍然会发生和流行，这说明PEDV在环境压力下一直处于变异的状态，这可能是导致近年PEDV的大规模暴发，而不能以疫苗接种等措施控制此病流行的主要原因。目前，对此病没有有效的治疗措施，所以在发生疾病的猪场中隔离感染、发病猪只，做好生物安全措施是目前最好的方法[15]。

本试验从四川某地采集了仔猪小肠进行RTPCR鉴定，利用Vero细胞进行分离培养，盲传3代后出现细胞病变，而且随着传代次数的增加出现细胞病变的时间以及形态逐渐稳定，通过RTPCR、间接免疫荧光鉴定、基因序列测定，证实分离到的病毒为PEDV，命名为X-6/2021株。对X-6/2021株S1基因进行RT-PCR扩增，获得的分离株S1全基因与国内外PEDV毒株进行序列比对和遗传进化分析，结果显示，PEDV-X-6/2021毒株与Ⅰ型参考毒株的同源性为90.6%～93.2%，与Ⅱ型参考毒株的同源性为97.6%～99.0%。显示PEDV毒株一直处在不断遗传演化过程中，遗传关系表明，PEDV-X-6/2021毒株与近年来发现的毒株在同一分支上，均为流行毒株，即为Ⅱ型毒株。S1基因序列的不断变化，势必会影响S蛋白诱导机体产生中和抗体的重要能力，进一步影响到现有PED疫苗的保护效果。现在的PEDV流行毒株与经典毒株的亲缘关系较远，若还是用经典株进行免疫，有可能导致猪群免疫失败。在近些年来，PEDV变异株也越来越引起大家的重视。