银杏半同胞家系叶主要功能性状及组分含量差异

许继业，牟志刚，刘国华，郁万文

（1.南京林业大学 南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 210037；2.日照市公用事业管理服务中心，山东日照 276827；3.江苏农林职业技术学院 风景园林学院，江苏 句容 212400）

实生育苗繁殖方法简便，易于操作，种子来源广，便于规模化繁殖，用这种方法繁殖出的实生苗具有根系发达、主根强大、入土较深、植株健壮、抗逆性强、寿命长等特点。所以生产中，银杏Gingko biloba叶用园多采用直接播种实生育苗方法。较多研究结果表明，从家系水平选育叶用银杏优良种质是可行的。张云跃等[1]经研究发现，银杏叶中类黄酮和萜内酯含量在产区间、产区内、家系间、家系内以及单株间均有广泛的遗传差异；于国栋等[2]提出，在培育以药用为主的叶用银杏人工原料林时，应采用“产地-家系-单株”的联合选育模式进行良种选育；肖新华等[3]也认为银杏叶用良种的最佳选择途径为种源、家系联合选择。在叶用银杏园的经营过程中，在栽培环节注重的是银杏叶产量，在加工利用环节注重的是银杏叶品质。与国外相比，我国叶用银杏的栽培存在起步晚、叶质量不稳定等问题[4]。因此，亟待开展高产优质叶用银杏家系资源研究，选育并推广有效成分含量高且稳定的家系。本研究中以38 个银杏半同胞家系为材料，测定银杏叶主要功能性状和功能组分（类黄酮、萜内酯、聚戊烯醇）的含量，探究银杏叶主要功能性状和功能组分含量在家系间的差异，筛选叶功能性状和功能组分含量兼优的叶用家系，旨在为叶用银杏种植提供优良的播种材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

参试银杏家系的母树为邳州市银杏种质资源圃的38 个银杏优良无性系，母树基本信息见表1。2019年9月，从38 个银杏无性系母树上采集种实，经脱皮调制后通过低温层积沙藏完成生理后熟。2020年3月中旬，经催芽后，播种于口径10 cm、高30 cm 的营养钵中，每个营养钵1 粒，每家系播种100 粒。播种后，进行浇水、除草等常规管理。2020年9月15日，每家系随机采集4 个单株的全株叶片，按单株存放，进行表型指标测定。随机采集另外4 个单株的全株叶片，按单株存放，于105 ℃杀青15 min，60 ℃烘干至恒定质量，粉碎过40 目筛，即得功能性组分含量待测材料。

表1 参试银杏家系母树的采集地Table 1 The collection site of mother tree of each G.biloba family for study

1.2 指标测定

1.2.1 叶表型指标

使用EPSON 扫描仪将叶片扫描成图片；利用Photoshopc cs6 软件的直方图功能计算叶面积；使用1/1 000 电子天平测定其干质量，重复3 次。以叶干质量除以其叶面积得到比叶干质量。

1.2.2 总黄酮含量

总黄酮的提取及测定方法参照文献[5]，略有改动。色谱条件：色谱柱为Supersil ODS2（4.6 mm×150 mm，3 μm），流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液（56∶44），柱温35 ℃，流速1 mL/min，进样量10 μL，检测波长360 nm。采用外标法对样本定量，黄酮组分标准曲线见表2。计算总黄酮含量（ωf）：

表2 银杏类黄酮标准品的标准曲线方程†Table 2 Standard curve equation of three G.biloba flavonoid component standards

ωf=2.51×(ωq+ωc+ωi)。

式中：ωq为槲皮素质量分数，ωc为山柰酚质量分数，ωi为异鼠李素质量分数。

1.2.3 萜内酯含量

萜内酯的提取及测定参照张渝阳等[6]的方法，略有改动。以银杏内酯A 标准品绘制标准曲线，以银杏内酯A 的浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，采用最小二乘法拟合标准曲线，得到曲线方程y=2.4834x+0.061，r=0.999。计算萜内酯含量（ωt）：

ωt=xt×n×V1/(V×W)。

式中：xt为利用曲线方程换算出的银杏内酯A 的浓度，n为稀释程度，V1为样品溶液总体积，V为参试样品体积，W为样品质量。

1.2.4 聚戊烯醇含量

聚戊烯醇的提取及测定参照王成章[7]和杨克迪等[8]的方法，略有改动。以聚戊烯醇标准品绘制标准曲线，以聚戊烯醇的浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，采用最小二乘法拟合曲线，得到曲线方程y=0.457 1x+0.325 5，r=0.998。计算聚戊烯醇含量（ωp）：

ωp=xp×n×V1/(V×W)。

式中：xp为利用曲线方程换算出的聚戊烯醇浓度。

1.3 数据处理

使用Excel 2010 软件进行数据汇总，使用SPSS 22.0 软件进行单因素方差分析、Duncan 多重比较、Pearson 相关性分析，使用Origin 2020 软件进行主成分分析和聚类分析。采用隶属函数法对各银杏半同胞家系的叶用价值进行综合评价。

主成分分析：

式中：Ci为第i个综合指标得分，Yj为第i个主成分载荷矩阵表中初始因子j的载荷矩阵，λi为第i个主成分相对应的特征值，Xj′是第j个原始指标值经过标准化处理后的值。

μ(Xj)=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)。

式中：Xj为第j个指标的值，Xmin为第j个综合指标的最小值，Xmax为第j个综合指标的最大值，μ(Xj)是第j个指标的隶属函数值。

式中：wj为第j个综合指标的权重，pj为第j个综合指标的贡献率。

式中：D为综合评价值。

2 结果与分析

2.1 银杏半同胞家系间叶功能性状的差异

参试银杏家系单叶干质量、单叶面积和比叶干质量见表3。方差分析和多重比较结果显示，单叶干质量、单叶面积和比叶干质量在各银杏家系间均呈现极显著差异（P＜0.01）。各家系单叶干质量为51.0 ～120.2 mg，变异系数为21.7%，其中单叶干质量最大的是16 号，为最小值（70 号）的2.36 倍，单叶干质量高于均值（83.179 mg）的家系共有17 个。各家系单叶面积为12.617 ～28.854 cm2，变异系数为19.0%，其中单叶面积最大的是16 号，为最小值（20 号）的2.29 倍，单叶面积高于均值（19.919 cm2）的家系共有17 个。各家系比叶干质量为3.532 ～4.776 mg/cm2，变异系数为7.5%，其中比叶干质量最大的是18 号，为最小值（70 号）的1.35 倍，比叶干质量高于均值（4.150 mg/cm2）的家系共有17 个。单叶干质量、单叶面积在银杏家系间的变异系数均大于10%，说明这2 个指标在家系间存在广泛变异，这为筛选大叶银杏家系提供了物质基础。

表3 参试银杏家系叶功能性状†Table 3 The main functional traits of 38 G.biloba families

2.2 银杏半同胞家系间叶功能性组分含量的差异

参试银杏家系叶片总黄酮、萜内酯、聚戊烯醇含量见表4。方差分析和多重比较结果显示，总黄酮、萜内酯、聚戊烯醇含量在银杏家系间存在极显著差异（P＜0.01）。各银杏家系叶片的总黄酮质量分数为11.244 ～26.595 mg/g，变异系数为20.2%，其中总黄酮质量分数最高的是18 号，为最小值（39 号）的2.37 倍，总黄酮质量分数高于均值（15.629 mg/g）的家系共有17 个。各银杏家系叶片的萜内酯质量分数为4.060 ～6.778 mg/g，变异系数为11.1%，其中萜内酯质量分数最高的是65 号，为最小值（23 号）的1.67 倍，萜内酯质量分数高于均值（5.302 mg/g）的家系共有17 个。各银杏家系叶片的聚戊烯醇质量分数为7.654 ～36.848 mg/g，变异系数为36.3%，其中聚戊烯醇质量分数最高的是68 号，为最小值（21 号）的4.81 倍，聚戊烯醇质量分数高于均值（19.376 mg/g）的家系共有14 个。叶片的总黄酮、萜内酯、聚戊烯醇含量在银杏家系间的变异系数均大于10%，说明银杏叶中3 个主要功能组分含量在家系间存在丰富的变异，这为筛选高品质的叶用银杏家系提供了物质基础。

表4 参试银杏家系叶功能组分的质量分数†Table 4 The contents of main functional components of 38 G.biloba families mg/g

2.3 银杏家系叶功能性状及组分含量的相关性

银杏家系叶功能性状及组分含量的相关系数见表5。由表5可知：叶主要功能性状中的单叶干质量与单叶面积、比叶干质量均呈现极显著正相关（P＜0.01）；单叶面积与比叶干质量呈现弱度正相关，未达到显著水平（P＞0.05）。叶主要功能成分总黄酮质量分数、萜内酯质量分数以及聚戊烯醇质量分数两两间无显著相关性（P＞0.05）。总黄酮质量分数与单叶干质量、单叶面积呈现弱度负相关，与比叶干质量呈现正相关，均未达到显著水平（P＞0.05）；萜内酯质量分数与单叶干质量、单叶面积、比叶干质量均呈现极显著正相关（P＜0.01）；聚戊烯醇质量分数与单叶干质量、单叶面积、比叶干质量均呈现弱度负相关，均未达到显著水平（P＞0.05）。

表5 参试银杏家系叶功能性状及组分含量的相关系数†Table 5 Correlation of leaf functional traits and component contents of 38 G.biloba families

2.4 银杏家系叶功能性状与组分含量的综合评价

参试银杏家系各指标的主成分分析结果见表6。经过主成分分析，将6 个单项指标转换成综合指标，根据累计贡献率大于80%的原则筛选出前3个综合指标，贡献率分别为43.333%、22.146%、16.173%，累计贡献率为81.625%。由表6可知，在第1 主成分中，单叶干质量、单叶面积、比叶干质量、萜内酯质量分数的载荷较大且均为正向载荷，主要反映了叶功能性状和萜内酯质量分数；在第2主成分中，总黄酮的载荷最大，反映了总黄酮质量分数；在第3 主成分中，聚戊烯醇质量分数的载荷较大，反映了聚戊烯醇质量分数。

表6 参试银杏家系各叶用指标的主成分分析结果Table 6 Principal component analysis results of individual leaf- using indexes of 38 G.biloba families

参试银杏家系叶用价值的综合评价值见表7，各家系的综合评价值越大，表明其叶用价值越高，反之越低。银杏家系根据综合评价值由大到小排序依次为18、65、54、30、27、36、16、28、37、39、51、34、9、21、31、43、44、42、14、47、52、67、57、19、46、61、29、59、20、68、25、63、13、23、48、40、60、70。

表7 参试银杏家系叶用价值的综合评价值和排名†Table 7 Comprehensive evaluation value and ranking of leaf use value of 38 G.biloba families

2.5 基于叶用价值的银杏家系聚类

以前3 个主成分得分值与权重的乘积为指标，采用“欧式距离-类平均法”对38 个参试银杏家系进行聚类，结果如图1所示。由图1可见，当欧式距离为0.65 时，可将38 个家系分为5 个类群。各类家系叶用指标的平均值见表8。第Ⅰ类仅包括18 号家系，此类家系的比叶干质量、总黄酮含量、萜内酯含量最高，单叶干质量、单叶面积中等偏上，聚戊烯醇含量最低；第Ⅱ类包括68 号家系，此类家系的聚戊烯醇含量最高，其余各指标处于中等偏下水平；第Ⅲ类包括20、23、40、48、60、70号家系，此类家系单叶干质量、单叶面积、比叶干质量、萜内酯含量均为最低，总黄酮含量处于中等、聚戊烯醇含量中等偏上；第Ⅳ类包括16、30、34、36、39、54、65 号家系，此类家系的单叶干质量和单叶面积最大，比叶干质量、萜内酯含量中等偏上，聚戊烯醇含量处于中等，总黄酮含量最低；第Ⅴ类为剩余所有家系（23 个），此类家系的总黄酮含量中等偏上、聚戊烯醇含量中等偏下，其余指标均中等水平。

图1 基于叶用价值的参试银杏家系聚类结果Fig.1 Clustering results of G.biloba families based on leaf value

表8 各类银杏家系叶用指标的平均值Table 8 Average value of leaf use index in various G.biloba families

根据主成分分析和聚类分析结果，筛选出较优的8 个家系（16、18、30、34、36、39、54、65 号），这些家系的单叶干质量和单叶面积最大，比叶干质量、萜内酯含量中等偏上，其中18 号家系的比叶干质量、叶片总黄酮和萜内酯含量均最高。可根据生产实践，进一步区划试验或定向推广这8 个叶用优良家系。值得注意的是，68 号家系具有最高的聚戊烯醇含量，可作为高聚戊烯醇特异家系进行定性培育。

3 结论与讨论

不同银杏半同胞家系间叶片主要功能性状（单叶干质量、单叶面积、比叶干质量）和主要功能组分（总黄酮、萜内酯、聚戊烯醇）含量均存在极显著差异，呈现出较高的遗传变异，变异系数为7.5%～36.3%，为叶用银杏家系筛选提供了物质基础。叶片主要功能性状中的单叶干质量与单叶面积、比叶干质量均呈现极显著正相关；叶主要功能组分总黄酮、萜内酯、聚戊烯醇的质量分数间均无显著相关性；主要功能组分中仅萜内酯含量与单叶干质量、单叶面积、比叶干质量均呈现极显著正相关。基于3 个综合指标，联合应用隶属函数综合评价和聚类分析，筛选出较优的8个家系（16、18、30、34、36、39、54、65 号），这些家系的单叶干质量和单叶面积最大，比叶干质量、萜内酯含量中等偏上，其中18 号家系的比叶干质量、叶片总黄酮和萜内酯含量均最高。可根据生产实践，进一步区划试验或定向推广这8个家系。另外，68 号家系具有最高的聚戊烯醇含量，可作为高聚戊烯醇特异家系进行定性培育。

植物遗传变异是良种选育的基础，植物个体差异受基因和环境因子共同影响，分布在不同气候地区的同种植物往往会发生较大变异，并通过种子保存下来[9]。大量研究结果表明，银杏不同种源、居群、家系、单株的叶中功能性组分的含量均具有显著差异[3-4,10-14]。郁万文等[4]经研究发现，54 个供试银杏无性系间黄酮、萜内酯含量存在遗传变异；Zhou 等[13]经研究发现，10 个地理居群银杏叶功能组分含量存在极显著差异。本研究结果表明，38 个银杏半同胞家系间叶片功能性状及功能组分含量均存在极显著差异（P＜0.01），其中变异系数超过10%的叶功能性状有单叶干质量、单叶面积，其含量的变异系数超过10%的叶功能组分有总黄酮、萜内酯、聚戊烯醇，表现出较高的变异性和遗传多样性。本研究中栽培条件一致，故基因是造成差异的主要因素，这为叶用银杏优良种质筛选提供了可能性。

本研究结果表明，3 个功能组分中仅萜内酯含量与单叶干质量、单叶面积、比叶干质量呈现极显著正相关，说明可以通过单叶干质量、单叶面积及比叶干质量等叶功能性状来预测叶片萜内酯含量，或基于叶片萜内酯含量进行特异种质资源的初选。叶片的总黄酮、萜内酯、聚戊烯醇含量间均无显著相关性，说明不能从供试的家系中选育出总黄酮、萜内酯和聚戊烯醇含量两者较高或三者均较高的家系。进一步说明不能从供试的家系中选育出叶功能指标较好、多功能组分含量较高的家系，所以有必要对供试家系进行综合评价，从中选育出2 类指标均较优的家系。

迄今，已有大量有关造林树种家系的筛选与评价的研究报道。樊民亮[15]在研究马尾松子代变异及优良亲本选择时设定不同入选率，入选家系遗传增益随着入选率的降低而升高。谢乐[16]以10%的入选率选择厚荚优良材用半同胞子代；阙青敏[17]认为不同选择水平的选择增益不同，通过多层次的综合选择，能获得较大的增益。覃敏[18]在选育材用米老排时，以育种值为评价依据，按25%的入选率选择优良家系。栾柯权[19]采用“布雷金”多性状综合评定法对水曲柳半同胞家系进行综合评价，并以10%的入选率选择优良材用家系。李光友等[20]按适生型家系7/51 的入选率，计算出供试杂交桉在家系、单株水平的遗传增益值；按优于对照无性系得分值15/51 的入选率，计算出供试杂交桉在家系、单株水平的遗传增益值。然而，上述研究中的优良家系入选率均是人为界定的，缺少理论依据和数据支撑。聚类分析常被用在种质资源评价中，可以综合多项指标对植物进行综合评价和分类。在界定类群时，应兼顾入选率和遗传增益，使入选率不能过高或过低，同时具有较高的遗传增益，一般以3 ～6 类为宜。但是聚类分析中赋予各指标的权重均相等，忽视了不同指标的贡献率，通过主成分分析则可以对新产生的综合指标进行权重赋值。因此，本研究中在确定叶功能性状和功能组分含量的目标性状基础上，基于3 个综合指标，联合应用隶属函数综合评价和聚类分析，筛选出较优的8 个家系，单叶干质量和单叶面积最大，比叶干质量、萜内酯含量中等偏上。其中，18 号家系的比叶干质量、叶片总黄酮和萜内酯含量均最高。

银杏叶产量及叶中功能组分含量会随着苗龄的增加而变化，本研究中仅探讨了1年生家系银杏叶功能性状和功能组分含量的差异，且未涉及家系内单株间的差异。为了筛选出叶大、功能组分含量高的家系及家系内单株间叶功能性状及功能组分含量差异小的家系，有必要对这些银杏家系，尤其是初选出的8 个家系进行连年定位研究，并进行家系内单株间银杏叶功能性状及功能组分含量的稳定性或差异性研究。