油茶果壳提取物及其生物活性

刘泽文，王 伟，黄永芳，吴春银，史晓雨，单体江

（华南农业大学 a.林学与风景园林学院；b.植物保护学院，广东 广州 510642）

油茶Camellia oleifera为山茶科Theaceae 山茶属Camellia多年生乔木，主要分布于我国长江流域及其以南的14 个省（区）[1-3]，与椰子、油棕、油橄榄并称为世界四大木本食用油料树种[4-5]。油茶及其副产物是筛选具有抗菌、抗氧化和杀线虫活性物质的重要来源[6-7]。大量研究结果表明，油茶籽饼水提液对香蕉枯萎病尖孢镰刀菌等11 种植物病原菌具有较强的抑制作用[8]，同时在质量浓度为50 g/L 时，对离体松材线虫培养48 h 后的活性抑制作用可达到100%，展现了良好的抗菌和杀线虫活性[9]。油茶籽、花、果壳、枝和根等不同部位提取物也展现了不同程度的抗氧化活性[10-13]。油茶果壳是油茶的重要副产物，富含黄酮、多酚、皂荚素、多糖等成分[14-15]，具有抗氧化、防衰老、抑菌消炎、预防心血管疾病和抗癌等多种生物活性，在生物医药领域具有广泛的应用[16]。大量油茶果壳的丢弃不仅浪费资源，还会造成环境污染[17]。

目前，有关油茶果壳在防治农林业病原真菌及松材线虫方面应用的研究报道较少。本研究中采用乙酸乙酯冷浸提取法提取油茶果壳的次生代谢产物，并测定提取物的抗真菌、抗氧化以及杀线虫活性，以期为植物病害的防治提供新思路，为油茶果壳的综合开发和利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试样品来源

2018年11月28日，在广东省广州市增城区华南农业大学增城教学科研基地采集油茶果壳样品。样树共计28 种，分别为‘岑软1 号’‘岑软2 号’‘岑软3 号’‘岑软6 号’‘岑软7 号’‘岑软11 号’‘岑软24 号’‘岑溪软枝油茶’‘长林27 号’‘璠龙4 号’‘璠龙5 号’‘赣石84 号’‘赣无2 号’‘赣无20 号’‘赣兴46 号’‘桂无1 号’‘桂无2 号’‘桂无3 号’‘桂无4 号’‘桂无5 号’‘田软6 号’‘湘林5 号’‘湘林29 号’‘湘林81 号’‘阳春1 号’‘阳春2 号’‘粤高油9 号’‘粤高油10 号。

1.1.2 供试病原菌及线虫

供试病原菌为油茶炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides，供试线虫为松材线虫Bursaphelenchus xylophilus，均由华南农业大学林学与风景园林学院植物与微生物健康实验室提供。

1.1.3 仪器与试剂

仪器：BJ-150 型粉碎机（浙江拜杰电器有限公司）、SW-CJ-2FD 型超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）、LRH 系列生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、旋转蒸发仪RE-52AA（上海亚荣生化仪器厂）、JA2003N 型分析天平（上海精密科学仪器有限公司）、MLS-3870 三洋高压灭菌锅（松下电器产业株式会社，日本）、Exceed-Cb 型超纯水机（成都唐氏康宁科技发展有限公司）、LC-16 分析型高效液相色谱仪（岛津企业管理有限公司）。

试剂：98.4%多菌灵（中国农科院植保所廊坊农药中试厂），甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯、二甲基亚砜等有机溶剂（天津市富宇精细化工有限公司）均为分析纯，甲醇、乙腈（上海星可高纯溶剂有限公司）均为色谱纯，葡萄糖（天津市大茂化学试剂厂），琼脂（健阳生物科技有限公司），1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,6-二叔丁基对甲基苯酚（BHT）等药品（Sigma-Aldrich 公司，美国）。

1.2 方 法

1.2.1 油茶果壳提取物的制备和分析

将油茶果壳在自然环境下风干，用粉碎机研成粉末。称取各品种油茶果壳粉末1 g，并将其加入装有40 mL 乙酸乙酯的离心管中，冷浸振荡提取3 次，将提取液减压浓缩至干，即得各品种油茶果壳提取物。称取各品种油茶提取物，配制1 mL 质量浓度为10 g/L 的样品溶液，使用0.22 μm 有机滤膜过滤，备用。使用高效液相色谱仪对各样品溶液进行分析。流动相为乙腈和水，使用二极管阵列检测器检测，采用梯度洗脱系统。色谱条件：0 ～1 min 20%乙腈等度洗脱，1 ～16 min 乙腈（体积分数由20%上升到100%）洗脱，16 ～17 min 100%乙腈洗脱。

根据高效液相色谱分析结果，对28 种油茶进行分类，从每类中选取1 种具有代表性的油茶品种大量制备其果壳提取物，用于生物活性测定。

1.2.2 提取物抗油茶炭疽病菌活性的测定

采用菌丝生长速率法测定不同品种油茶果壳提取物对油茶炭疽病菌的抑制活性[18]。供试样品的初始质量浓度为150 g/L，使用30%的DMSO依次倍半稀释成质量浓度为75、37.5、18.75、9.375、4.687 5 和2.343 75 g/L 的样品溶液。分别取1 mL不同质量浓度的样品溶液加入到29 mL PDA 培养基中，混合均匀，制成样品平板。将活化好的油茶炭疽菌饼（6 mm）接种于PDA 平板上。以加入无菌水、30% DMSO、98.4%多菌灵的PDA 培养基分别作为空白对照、阴性对照和阳性对照，每处理重复3 次，28 ℃条件下培养5 d 左右。待空白对照菌落生长至培养皿面积的2/3 时，采用十字交叉法测量各处理菌落生长直径并计算抑菌率。

I=[(L1-L2)/L1]×100%。

式中：I表示抑菌率，L1表示阴性对照菌落纯生长量（菌落直径与菌饼直径的差值），L2表示处理菌落纯生长量。

使用Excel 软件分析数据，将供试样品质量浓度取对数（X），将抑菌率换算为概率（Y），计算有效抑制中浓度（EC50）。

1.2.3 提取物抗氧化活性的测定

采用多孔板-DPPH 法测定不同品种油茶果壳提取物对DPPH 的清除力[19]。供试样品的初始质量浓度为40 g/L，使用30%的DMSO 依次倍半稀释成质量浓度为20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 和0.156 25 g/L 的样品溶液。阳性对照为BHT，初始质量浓度为2 g/L，使用30%的DMSO对半稀释成质量浓度为1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625 和0.007 812 5 g/L 的阳性对照溶液。取80 μL 质量浓度为200 mg/L 的DPPH 无水乙醇溶液以及20 μL 系列浓度的样品溶液或阳性对照溶液，加入96 微孔板中，以20 μL 30%的DMSO 溶液作为空白对照，避光振荡摇匀，在37 ℃下水浴30 min，使用酶标仪于517 nm 波长处测定吸光度。每个样品均做4 个重复，每个重复测定3 次。计算供试样品的DPPH 清除率。

C=[(Ac-As)/Ac]×100%。

式中：C表示DPPH 清除率，Ac表示空白对照在517 nm 波长处的吸光度，As表示样品溶液在517 nm 波长处的吸光度。

使用Excel 软件分析数据，将供试样品质量浓度取对数（X），将DPPH 清除率换算为概率（Y），计算有效中浓度（IC50）。

1.2.4 提取物抗松材线虫活性的测定

采取触杀法测定不同品种油茶果壳提取物的杀线虫活性[20]。用无菌水将高浓度的线虫水悬浮液稀释至300 ～500 头/mL。取不同品种油茶果壳提取物20 mg，使用400 μL 30%的DMSO 溶剂溶解，并依次倍半稀释成50、25、12.5、6.25、3.125和1.562 5 g/L 的样品溶液，备用。在96 微孔板中每孔加入90 μL 线虫悬浮液，然后加入待测样品液10 μL，3 次重复，以30%的DMSO 为阴性对照。每隔24、48、72 h 统计线虫死亡率，并进行校正。

D=[(N1-N2)/(1-N2)]×100%。

式中：D表示校正死亡率，N1表示处理组死亡率，N2表示阴性对照死亡率。

使用Excel 软件分析数据，将供试样品质量浓度取对数（X），将校正死亡率换算为概率（Y），计算半抑制浓度（IC50）。

2 结果与分析

2.1 不同品种油茶果壳的次生代谢产物

根据高效液相色谱分析结果，将28 种油茶分为Ⅰ～Ⅶ类。Ⅰ类为‘岑软1 号’，Ⅱ类为‘璠龙5 号’，Ⅲ类为‘璠龙4 号’‘赣石84 号’，Ⅳ类为‘长林27 号’‘桂无3 号’‘粤高油10 号’，Ⅴ类为‘桂无4 号’，Ⅵ类为‘岑软2 号’‘岑软3 号’‘岑软11 号’‘岑软24 号’‘赣无2 号’‘赣无20 号’‘赣兴46 号’‘桂无1 号’‘桂无2号’‘桂无5 号’‘湘林5 号’‘湘林29 号’‘湘林81 号’‘阳春1 号’‘阳春2 号’，Ⅶ类为‘岑软6 号’‘岑软7 号’‘岑溪软枝油茶’‘田软6号’‘粤高油9 号’。从每类中选取1 种具有代表性的油茶品种，分别为‘岑软1号’‘璠龙5号’‘赣石84 号’‘桂无3 号’‘桂无4 号’‘桂无5 号’和‘粤高油9 号’，其果壳提取物在210 nm 下的高效液相色谱分析结果如图1所示。由图1可见，7 种油茶果壳提取物均含有丰富的次生代谢产物，但不同品种油茶果壳的次生代谢产物的分布、种类和含量存在一定的差异。7 种油茶果壳的次生代谢产物主要集中在保留时间3.0 ～11.0 min 处，在保留时间约为3.5、7.5 和10.0 min 处具有相同化学物质，但相对含量不同。‘桂无3 号’果壳的次生代谢产物种类最多，‘桂无3 号’‘粤高油9号’和‘璠龙55 号’在保留时间为3.0 min 处存在与其他品种不同的化学信号。

图1 各类代表性品种油茶果壳提取物高效液相色谱分析结果Fig.1 HPLC chromatograms of the fruit shell extracts from different varieties of C.oleifera

2.2 不同品种油茶果壳提取物的抗油茶炭疽病菌活性

各类代表性品种果壳提取物对油茶炭疽病菌均表现出一定的抑制作用。其中，‘赣石84 号’果壳提取物对油茶炭疽病菌的抑制作用最强，EC50值为(2.02±0.09) g/L。‘岑软1 号’‘粤高油9 号’次之，EC50值分别为(2.65±0.38)、(2.84±0.19) g/L。‘桂无5 号’‘桂无3 号’‘璠龙5 号’和‘桂无4 号’果壳提取物的EC50值依次为(6.70±0.34)、(3.30±0.59)、(4.41±0.33)、(4.91±0.24) g/L。但所有样品对油茶炭疽病菌的抑制效果明显弱于阳性对照98.4%多菌灵，其EC50值为(0.70±0.10) mg/L。结果表明，‘赣石84 号’果壳提取物的抗油茶炭疽病菌活性最强。

2.3 不同品种油茶果壳提取物的抗氧化活性

各类代表性品种果壳提取物均具有一定的抗氧化活性。其中，‘桂无4 号’果壳提取物的抗氧化活性最强，其IC50值为(5.80±0) mg/L，强于阳性对照的IC50值(25.90±0) mg/L。其次是‘璠龙5 号’‘粤高油9 号’‘赣石84 号’果壳提取物，其IC50值分别为(36.80±0)、(48.60±0.02)、(92.10±0.02) mg/L。‘岑软1 号’‘桂无3 号’‘桂无5 号’果壳提取物也表现出一定的抗氧化活性，其IC50值分别为(119.30±0.05)、(199.70±0.01)、(516.40±0.28) mg/L，‘桂无5 号’果壳提取物的抗氧化活性最弱。结果表明，‘桂无4 号’果壳提取物的抗氧化活性最强。

2.4 不同品种油茶果壳提取物的杀线虫活性

各类代表性品种果壳提取物对松材线虫的抑制效果见表1。由表1可知，除‘赣石84 号’和‘粤高油9 号’果壳提取物外，其他供试样品对松材线虫均表现出一定的抑制作用，但不同样品之间存在差异。其中，‘璠龙5 号’果壳提取物在处理24、48、72 h后的IC50值分别为(9.65±1.54)、(5.03±0.73)、(3.72±0.12) g/L。其次是‘岑软1 号’果壳提取物，其IC50值为8.86 ～11.38 g/L。‘桂无3 号’果壳提取物在处理24 h 后开始显现杀线虫活性特征，其IC50值为7.41 ～15.91 g/L。‘桂无5 号’果壳提取物的杀线虫活性最差，其在处理72 h 后开始出现明显的杀线虫活性特征，其IC50值为17.62 ～18.26 g/L。结果表明，‘璠龙5 号’果壳提取物具有最好的杀线虫活性。

表1 各类代表性品种油茶果壳提取物对松材线虫的杀线活性†Table 1 Nematicidal activities against B.xylophilus of the fruit shell extracts from different varieties of C.oleifera g/L

3 结论与讨论

不同品种油茶果壳提取物在抗真菌、抗氧化和杀线虫活性方面存在明显差异。根据油茶果壳次生代谢产物的高效液相色谱分析结果，可将28 个油茶品种划分为7 大类。从每类中选1 个具有代表性的油茶品种，测定其果壳提取物的抗真菌、抗氧化和杀线虫活性。其中：‘赣石84 号’果壳提取物对油茶炭疽病菌的抑制效果最好，其EC50值为(2.02±0.09) g/L；‘桂无4 号’果壳提取物的抗氧化活性最强，其IC50值为(5.80±0) mg/L，强于阳性对照BHT 的IC50值(25.90±0) mg/L；‘璠龙5号’果壳提取物表现出较好的杀线虫活性，其在处理24、48 和72 h 后的IC50值分别为(9.65±1.54)、(5.03±0.73)、(3.72±0.12) g/L。‘赣石84 号’‘桂无4 号’‘璠龙5 号’可作为候选油茶品种，进一步用于果壳提取物活性成分的鉴定。

油茶为我国重要的木本油料树种，具有良好的适应性和较高的经济价值，在我国南方广大红壤丘陵地区有广泛种植[2,21]。油茶果壳为油茶加工产业的主要副产物，目前亟待加强开发利用。有研究结果表明，油茶果壳提取物表现出较好的抗真菌和抗氧化活性可能与其富含酚类、皂苷、萜类和生物碱类等次生代谢产物有关[22-26]。此外，这些物质还能促进作物生长，减少病虫害发生，提高作物的产量和质量[27-28]。本研究中分别采用菌丝生长速率法、多孔板-DPPH 法和触杀法测定了7 个具有代表性油茶品种果壳代谢产物的抗真菌、抗氧化和杀线虫活性，结果表明‘赣石84 号’油茶果壳提取物对油茶炭疽病菌的抑制能力最强。左继林等[29]报道，在25 个赣无性系品种中，‘赣石84 号’是最优品种，具有一定的开发潜力。油茶果壳提取物的抗真菌活性可能与茶皂素有关，茶皂素提取纯度因品种和提取工艺不同而有所差异[27]。本研究中采用的提取方法并非茶皂素的最佳提取方法，后续可进一步研究不同品种油茶果壳茶皂素的含量差异。‘桂无4 号’果壳提取物对DPPH 表现出最强的清除能力，其IC50值为(5.80±0) mg/L，清除力甚至强于阳性对照BHT，与前人的研究结果一致[10,30]。通过高效液相色谱分析发现，7 类油茶果壳提取物均含有丰富的次生代谢产物，且存在一定的差异，以大极性和中等极性化合物居多，油茶果壳提取物表现出的抗真菌、抗氧化和杀线虫活性与这些成分的关系尚有待进一步研究。此外，本研究中仅对油茶果壳次生代谢产物进行了初步分析，应进一步分离鉴定其中的活性物质，阐明其化学结构和活性机理。