抱茎獐牙菜指纹图谱及4种有效成分含量测定研究

张 楠，许苗苗，杜赟赟，刘凤凤，陈洪卫，谢志民*

（1.西安市食品药品检验所，陕西 西安 710054；2.西安远大德天药业股份有限公司，陕西 西安 710119）

抱茎獐牙菜Swertia franchetianaH. smith是龙胆科獐牙菜属一年生草本植物，为传统藏药藏茵陈基原植物之一，分布于甘肃、青海、四川等地。其性凉、味苦，具疏肝利胆功效[1]，临床用于治疗肝胆类疾病效果显著[2]。现代研究表明，其所含有效成分主要为环烯醚萜类、黄酮类、酮类、三萜类化合物[3-4]。抱茎獐牙菜目前被收录到青海省地方标准中，质控参数主要为齐墩果酸的薄层色谱鉴别和獐牙菜苦苷的含量测定，文献研究也大多以单独或几个成分的含量测定作为质控方法[5-6]，此种采用对照品进行薄层鉴别和针对个别化合物的含量测定方法专属性差，难以有效控制其质量。中药指纹图谱作为评价天然药物或中药最有效方法之一[7]，从化学成分的角度整体反映药材的特性，专属性强，方法快速简便。基于此，本研究以抱茎獐牙菜为研究对象，建立了HPLC指纹图谱和4种有效成分的含量测定方法，两者结合为抱茎獐牙菜的鉴别、质量控制提供参考依据。

1 仪器与材料

Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；BT124S型电子天平（赛多利斯公司）。獐牙菜苦苷（批号：1017116-11180003，纯度：8.3%）、芒果苷（批号：110753-201817，纯度：98.4%）、龙胆苦苷（批号：110770-201918，纯度：99.1%）、当药醇苷（批号：111897-201001，纯度＞98%）、齐墩果酸（批号：110709-201808，纯度：91.1%）、当药苷（批号：110749-201718，纯度：100%）均购于中国食品药品检定研究院；异荭草苷（批号：111897-201001，纯度＞98%）、异牡荆苷（批号：111897-201001，纯度＞98%）购于北京中科质检生物技术有限公司；当药黄素（批号：190803-084，纯度＞98%）购于北京盛世康普化工技术研究院；甲基当药宁（批号：Z26S10S98826，纯度＞98%）购于上海源叶生物科技有限公司。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其它试剂为分析纯。10批样品为课题组于青海、四川等地自采或购于药材市场，经西安市食品药品检验所谢志民主任药师鉴定为龙胆科獐牙菜属抱茎獐牙菜Swertia franchetianaH. smith 的干燥全草，新鲜样品除去泥土等杂质，晾干，样品详细情况见表1。

表1 样品来源Tab. 1 Sample sources

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Welch Ultimate XB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A为乙腈，B为0.1%的磷酸水溶液，梯 度 洗 脱：0 ～ 30 min，8%A；30 ～ 60 min，8% →17%A； 60 ～ 70 min，17% → 25%A；70 ～ 115 min，25% → 55%A；115 ～ 135 min，55% → 85%A；体积流量：1.0 mL/min，柱温：30 °C，检测波长：0 ～ 115 min为240 nm，115 ～ 135 min为205 nm。

2.2 样品与对照品溶液的制备

2.2.1 样品溶液的制备 精密称取样品中粉约0.20 g，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率：270 W，频率：45 kHz）30 min，放冷，用80%甲醇补足失重，摇匀，取续滤液，即得。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取獐牙菜苦苷、芒果苷、龙胆苦苷、当药苷、异荭草苷、异牡荆苷、当药黄素、当药醇苷、甲基当药宁、齐墩果酸对照品适量，加甲醇制成浓度依次为1 604.0 μg/mL、97.0 μg/mL、81.4 μg/mL、201.6 μg/mL、 40.0 μg/mL、39.9 μg/mL、58.1 μg/mL、68.5 μg/mL、43.8 μg/mL、57.6 μg/mL的溶液，备用。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取S1样品，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”色谱条件下连续进样6次，记录色谱图。结果各共有峰相对保留时间及相对峰面积RSD分别小于1.37%和1.85%。6针样品相似度分析结果为0.970，表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 取S1样品，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，于0、2.5、5、8、12、16、20、24 h，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于2.0%。相似度结果为0.980，表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.3.3 重复性试验 取S1样品6份，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。各共有峰的相对保留时间RSD 均小于1.68%，相对峰面积RSD均小于2.5%，相似度结果为0.985，表明该方法重复性良好。

2.4 指纹图谱的建立及相似度评价

2.4.1 指纹图谱的建立 取10 批样品，按 “2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，得到10批样品的色谱图，再取“2.2.2”项下的对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，得到混合对照品色谱图，结果见图1。将10批供试品溶液色谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012）”软件进行分析，以S1样品图谱为参照图谱，对色谱峰进行多点校正后，自动匹配，生成对照指纹图谱，计算10批样品和对照指纹图谱之间的相似度，共标定16个共有峰，见图2。

图1 混合对照品(A)和抱茎獐牙菜供试品(B)色谱图Fig. 1 HPLC of mixed reference substance(A) and Swertia franchetiana sample(B)

图2 10批抱茎獐牙菜药材叠加指纹图谱Fig. 2 HPLC standard chromatographic fingerprint for 10 batches of Swertia franchetiana sample

2.4.2 峰的确认 16个共有峰经与对照品保留时间和紫外光谱对比，确认了1、2、3、4、5、6、7、10、11、16号峰分别为獐牙菜苦苷、芒果苷、龙胆苦苷、当药苷、异荭草苷、异牡荆苷、当药黄素、当药醇苷、甲基当药宁、齐墩果酸，以5号峰为参照峰（S）。

2.4.3 数据分析 以参照峰的保留时间和峰面积作为1，计算共有色谱峰的相对保留时间见表2，相对峰面积见表3，相似度计算结果分别为0.987、0.984、0.980、0.939、0.880、0.912、0.876、0.990、0.978、0.864。

表2 共有峰相对保留时间Tab. 2 Relative retention time of common peaks

表3 共有峰相对峰面积Tab. 3 Relative peak area of common peaks

2.5 化学计量分析

2.5.1 聚类分析 以10批样品中16个共有峰的峰面积为变量，用SPSS 22.0软件进行聚类分析，结果见图3。当分离距离为10时，10批样可聚为2类，S1、S2、S8、S9号聚为第一类，其余为第二类。

图3 聚类分析图Fig. 3 Cluster analysis diagram

2.5.2 主成分分析 以10批样品中16个共有峰峰面积作为变量，采用SPSS 22.0软件进行主成分分析，提取到4个主成分，累积方差贡献率为94.426%，见表4。载荷矩阵结果显示色谱峰4、13对主成分1的贡献最大；色谱峰1对主成分2的贡献最大；色谱峰

表4 主成分分析特征值和方差贡献率Tab. 4 Principal component analysis eigenvalue and variance contribution rate

8、10对主成分3的贡献最大；色谱峰2对主成分4的贡献最大。将10批样品中16个共有峰峰面积导入SIMCA 14.1软件绘制主成分分析图分析组间差异，结果与聚类分析结果一致，见图4。

图4 PCA得分图Fig. 4 PCA score chart

2.6 4种有效成分的含量测定

2.6.1 色谱条件 同“2.1”项前30 min色谱条件。

2.6.2 线性关系考察 取“2.2”项下的混合对照品溶液为线性关系考察混合对照品溶液⑦ ，再将该溶液用甲醇稀释至60%、40%、20%、10%、5%、1%浓度依次得到线性关系考察⑥、⑤、④、③、②、①号对照品溶液。按“2.1”项下条件测定，以进样量作为横坐标（X），测得的峰面积作为纵坐标（Y）进行线性回归，结果见表5。

表5 4 种有效成分的线性关系考察结果Tab. 5 Results of linear relationship among 4 active components

2.6.3 精密度试验 取“2.2”项下混合对照品溶液连续进样6次，獐牙菜苦苷、芒果苷、龙胆苦苷、当药苷4种有效成分峰面积的RSD分别为0.25%、0.38%、0.29%、0.15%，表明仪器精密度良好。

2.6.4 重复性试验 同“2.3.3”项下方法，4种有效成分峰面积的RSD分别为0.82%、0.36%、0.92%、1.05%，表明该方法重复性良好。

2.6.5 稳定性试验 同“2.3.2”项下方法，4种有效成分24 h峰面积的RSD分别为0.48%、0.82%、0.49%、0.56%，表明该方法在24 h内稳定性良好。

2.6.6 加样回收率试验 取已测定各成分含量的样品（S1）粉末6份，每份0.1 g，按已知含量的100%分别精密加入各成分浓度为獐牙菜苦苷4.241 mg/mL、芒果苷0.154 mg/mL、龙胆苦苷0.157 mg/mL、当药苷0.484 mg/mL的混合对照品溶液2 mL，待溶剂挥发后按照“2.3”项下方法制成供试品溶液，依法进样测定各成分含量，结果所测4个成分的平均加样回收率（RSD值）分别为99.56% （0.58%）、100.37%（1.23%）、98.63%（0.59%）、99.11%（1.02%），表明该方法准确度良好。

2.6.7 样品含量测定 取10批次样品，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，依法测定，结果见表6。

表6 10批抱茎獐牙菜中4种成分测定结果（n = 3）Tab. 6 Content results of 4 components in 10 batches of Swertia franchetiana（n = 3）

3 讨论

10 批样品指纹图谱相似度在0.86以上，表明各样品相似度较好，各色谱峰均达到基线分离，保留时间稳定，16个共有峰通过与对照品对照指认出了10个成分，包含了抱茎獐牙菜主要有效成分，所建立的指纹图谱可以作为抱茎獐牙菜的鉴别指标之一。

聚类分析结果显示10批抱茎獐牙菜分为两类，分别为青海境内自采样品和四川境内及药材市场采购的样品，显示了抱茎獐牙菜成分与地域分布及采收储存时间具有明显相关性。含量测定以獐牙菜苦苷、芒果苷、龙胆苦苷、当药苷作为指标性成分。獐牙菜苦苷具有解痉镇痛、清肝利胆、降血脂等多种作用，对多种实验性肝损伤具有保护作用[8]；龙胆苦苷是龙胆科植物中的主要活性成分，主要用于保肝、抗炎、抗病原微生物、健胃利胆等[9-10]；芒果苷药理学活性丰富，主要有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、保肝等作用，另外体外实验表明其对HBV-DNA复制具有明显抑制作用[11-12]；当药苷是一种存在于多种中药中的环烯醚萜类化合物，研究表明具有抗纤维化、抗炎、抗肿瘤等作用[13]。鉴于这4种成分在保肝利胆抗炎等方面均有明显的药理作用，且通过主成分分析表明其对主成分的贡献较大，以这4种成分作为抱茎獐牙菜的质量控制指标成分较为合理，所建立的含量测定方法色谱峰分离效果好，简便、快速、准确，可以作为抱茎獐牙菜质量控制方法。

4 结论

本试验建立了10批抱茎獐牙菜的HPLC指纹图谱和4种有效成分含量测定方法，方法稳定性、重复性好，结果准确，可为抱茎獐牙菜的鉴别和质量控制提供参考。后续研究应以有效成分作为指标对獐牙菜属以及其它种属如扁蕾属、花锚属的植物进行考察和筛选，建立各种或属的标准指纹图谱和质量控制方法，进而为藏茵陈的持续开发提供依据。