美洲大蠊提取物抑制肝癌HepG2细胞增殖的机制研究

2022-12-05赵树立张雪峰

现代中药研究与实践 2022年5期

吕洁，赵树立，张雪峰,3

(1.南京中医药大学药学院，江苏南京 210023；2.南京市第一医院临床研究中心，江苏南京 210012；3.江苏鼎泰药物研究股份有限公司，江苏南京 210000）

近年来，随着人口老龄化以及年轻人吸烟、不健康饮食、不规律作息等现象的增加，肝癌已成为世界第六大常见癌症和第四大癌症死亡原因[1]。肝细胞癌是最常见的肝癌类型，总体生存率较低，患者就医时大多已处于癌症中晚期，发现晚且预后差。中医药作为我国优秀传统文化遗产，具有难以比拟的优势，可以有效改善西医西药毒性大反应强的不足，减轻患者痛苦[2]。

美洲大蠊Periplaneta americana（L.）为蜚蠊科动物，民间俗称“蟑螂”。现代药理学研究表明，美洲大蠊具有促血管增生、保肝、促进创伤愈合[3]、强心升压[4]、抗菌[5]、抗病毒、抗肿瘤[6-8]、抗炎镇痛[9-11]、增强免疫力[12]等作用。在抗肿瘤方面，临床观察表明美洲大蠊提取物多肽及康复新液对原发性肝癌有一定缓解治疗作用，可有效延长患者生存时间，但其发挥药效作用机制尚不明朗[13-14]。本实验将在细胞和动物水平上探讨美洲大蠊提取物康复新液对肝癌细胞HepG2的凋亡诱导作用，并进一步探讨其抗肝癌机制，以期为该药物的临床广泛应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

35l型气套CO2培养箱（Thermo Fisher Scientific公司）；XW-80A型涡旋混合器（上海医大仪器有限公司）；BSA124S型分析天平（奥多利斯科学仪器有限公司）；CKX41型倒置显微镜（日本Olympus公司）；Spectra Max Plus 384型酶标仪（Molecular Devices公司）；BD C6型流式细胞仪（美国Becton ＆ Dickinson公司）；Mini-Protean@ Tetra型电泳槽、Mini Trans-Blot型转印槽、ChemiDOCTM XRS+型分子成像系统（Bio-Rad公司）。

美洲大蠊提取物：康复新液（批号：20200701），购于内蒙古京新药业有限公司，经37℃减压浓缩，挥去乙醇，得到浸膏。

RPMI培养基（Thermo Fisher Scientific公司）；胰蛋白酶、胎牛血清、过硫酸铵、MT（碧云天生物技术有限公司）；Cleaved Caspase-3 （D175）（5A1E）Rabbit、Cleaved Caspase-9 （D175）（5A1E）Rabbit（美国Cell Signaling Technology公司）；Annexin V-FITC/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒（诺唯赞公司）；蛋白预染Marker（美国Bio-Rad公司）；PVDF蛋白转移膜（美国Immobilon公司），其余试剂均为市售分析纯。

1.2 细胞株与动物

LO2和HepG2，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

BALB/c-nu裸鼠，SPF级，4～5周龄，雌性，体质量为19 ～ 21 g，由南京大学-南京生物医药研究所提供，正常饲养一周后开始实验。

1.3 细胞培养

在37 ℃，5% CO2培养箱中培养人肝癌细胞HepG2及LO2人正常肝细胞，使用含10% 胎牛血清的常规培养液，细胞贴壁生长，使用显微镜观察细胞生长情况，及时确认细胞是否能够正常生长。当细胞密度达80% ～ 90% 时，弃去培养基，PBS清洗两次，加入适量胰酶进行细胞消化，当细胞形态变圆，细胞间隙扩大后，吸出胰酶，然后加入含有胎牛血清的培养基使细胞消化终止，轻轻吹打下细胞，吸取转移到EP管，1 000 rpm 离心5 min后弃上清，用新鲜培养基重悬细胞，接种到新的无菌培养皿中，置于细胞培养箱中继续培养，每2 ～ 3 d换液或传代。

1.4 MTT比色法观察美洲大蠊提取物对人肝癌细胞HepG2增殖的影响

取对数生长期的HepG2细胞及LO2细胞，按照前述步骤消化后，利用细胞计数仪或细胞计数板计数后，制成细胞混悬液，接种于96孔板中，每孔5 000个细胞。培养24 h后，实验组分别加入培养基稀释的200 μL美洲大蠊提取物至药物终浓度分别为10、20、40、80 μg/mL，每个浓度设六个复孔，空白给药组加入等体积培养基，继续培养72 h，在试验终止前4 h按照20 μL/孔加入MTT。到达终止时间点时时，用移液器移走上清，每孔中加入DMSO 150 μL，震荡10 min，使结晶物充分溶解。使用酶标仪进行比色，选择570 nm波长检测各孔OD值。计算细胞生长抑制率：细胞生长抑制率（%） = （1－OD实验组/OD对照组）×100%。重复进行5次同样水平实验，计算平均细胞生长抑制率，并采用Graphpad软件计算IC50值。

1.5 流式细胞术检测美洲大蠊提取物对HepG2细胞凋亡的影响

取对数生长期的HepG2细胞接种到六孔板中，每孔30万细胞，待细胞贴壁后，给予不同浓度的美洲大蠊提取物并设置空白对照组，孵育48 h后，收集细胞，2 500 rpm离心5 min后弃上清，用PBS清洗2次，用500 µL 缓冲液混悬细胞，随后加入5 µL Annexin V-FITC和5 µL PI，37 °C避光孵育30 min，流式细胞仪检测细胞荧光。所得数据经Flow Jo软件处理，分析细胞凋亡率。

1.6 流式细胞术检测美洲大蠊提取物对HepG2细胞周期的影响

取对数生长期的HepG2细胞接种到六孔板中，每孔25万细胞。孵育24 h，然后加入美洲大蠊提取物，使终浓度分别为0、20、30、40、50 、60 μg/mL再处理48 h。收集细胞，用70% 冰乙醇4 ℃固定12 h。冰乙醇洗涤后，用染色缓冲液（根据细胞周期分析试剂盒配制）将细胞重悬。37 ℃孵育30 min 后，用流式细胞仪分析细胞样本。

1.7 细胞凋亡机制研究

将HepG2细胞按照5 000个/孔的细胞密度接种于96孔板，37 ℃培养24 h。然后用0.1% DMSO、溶解在培养基中的z-VAD（50 µM）或坏死抑制素-1（50 µM）孵育细胞2 h，再用溶解在培养基中的美洲大蠊提取物（60 µg/mL）孵育细胞72 h，加入MTT（5 mg/mL）孵育4 h。弃去悬浮液后，加入DMSO（150 µL）溶解晶体。设置对照组美洲大蠊提取物浓度为0，空白组只加培养基、MTT和DMSO。使用酶标仪进行比色，在570 nm处检测OD值。计算细胞存活率：细胞存活率（%）=（OD实验组－OD空白组）/（OD对照组－OD空白组）×100%。

1.8 蛋白印迹法检测Cleaved-Caspase-9、Cleaved-Caspase-3及Cleaved-PARP蛋白的表达

取对数生长期细胞，用不同浓度的美洲大蠊提取物预处理HepG2细胞48 h 后，胰酶消化，按照“1.3”项下方法收集细胞，2 500 rpm离心5 min 后弃上清液，并用预冷的PBS清洗两遍，将细胞转移到1.5 mL离心管中。加入细胞裂解液（含有PMSF、磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂），冰上裂解20 min 或-80 ℃过夜，12 000 rpm离心10 min，丢弃沉淀物收集上清液并转移到新的1.5 mL离心管中，利用BCA法测定蛋白浓度，加入适量的2× 蛋白上样缓冲液和裂解液来调整蛋白浓度，在100 ℃水浴锅中煮10 min，最后放入-80 ℃冰箱保存。配制10% SDS-PAGE分离胶与浓缩胶，将电泳胶装配到电泳槽后在样品孔中加入合适体积的样品，用适当电压进行凝胶电泳。使用半干转系统将蛋白从凝胶上转印于印迹膜上，TBST冲洗，封闭液封闭30 min。然后加入1∶ 1 000稀释的一抗，放入4 ℃冰箱过夜后，洗膜，加入1∶5 000稀释的二抗，置于摇床上平稳振摇1 h，洗膜3次，显色，照相。以Image J软件定量分析各蛋白表达水平。

1.9 对荷瘤小鼠肿瘤生长作用的影响

培养足够多的HepG2细胞，胰酶消化，按相同方法收集细胞，细胞计数仪计数后计算细胞总量，1 000 rpm离心5 min，弃去上清并用PBS清洗两遍，用PBS混悬细胞并调整细胞密度为1×107/mL，将细胞混悬液置于冰盒并准备给小鼠接种。5周龄雌性无胸腺裸鼠适应性喂养1周，用1 mL 无菌注射器给裸鼠后背部皮下注射200 µL细胞混悬液。当肿瘤体积达到100 ～ 200 mm3时，将造模成功的荷瘤小鼠按照随机分配原则分为5组，分别为对照组、索拉菲尼（20 mg/kg）组、美洲大蠊提取物低剂量组（50 mg/kg）、美洲大蠊提取物中剂量组（100 mg/kg）和美洲大蠊提取物高剂量组（200 mg/kg），每组6只。美洲大蠊提取物组每天灌胃注射50、100或200 mg/kg，索拉菲尼组每2 d灌胃一次，对照组用生理盐水处理。每间隔3 d仔细记录小鼠体质量，肉眼观察肿瘤大小，连续给药21 d后处死小鼠。收集肿瘤标本称量并用4%多聚甲醛固定，用于进一步病理切片和免疫组化分析。称量离体瘤块重量，计算各组抑瘤率：抑瘤率（%）=（模型组平均瘤重-实验组平均瘤重）/模型组平均瘤重× 100%。

1.10 统计学方法

用SPSS 22.0软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 MTT法检测美洲大蠊提取物对HepG2肝癌细胞株及正常肝细胞LO2的抑制率

不同浓度美洲大蠊提取物作用于正常肝细胞72 h，经MTT检测，IC50＞ 2 000 µg/mL，无明显的增殖抑制作用；而不同浓度美洲大蠊提取物作用于肝癌细胞HepG2 72 h后显示了一定抑制作用，IC50为（41.29±1.3 ）µg/mL。表明美洲大蠊提取物具有较好的抗肝癌活性，同时对正常细胞毒性较小，为下一步实验提供了浓度参考。

2.2 美洲大蠊提取物对HepG2细胞的凋亡诱导作用

Annexin-V可以检测细胞凋亡的早期阶段，其与碘化丙啶（PI）双染色可以区分凋亡细胞与坏死细胞。通过 AnnexinVFITC/PI 双染色法使用流式细胞仪检测美洲大蠊提取物检测人肝癌细胞HepG2凋亡，结果显示，美洲大蠊提取物作用于人肝癌细胞 48 h 后，其对HepG2细胞具有凋亡诱导作用，且呈现剂量依赖性，见图1。

图1 美洲大蠊提取物对HepG2细胞凋亡的影响（±s，n = 3）Fig. 1 Effect of Periplaneta americana extracts on apoptosis of HepG2 cells（±s，n = 3）

2.3 美洲大蠊提取物对HepG2细胞的周期阻滞作用

美洲大蠊提取物作用于肝癌细胞HepG2后，通过流式细胞术检测提取物对HepG2的周期阻滞作用，由实验结果可知，随着作用时间的延长，S期细胞明显减少，美洲大蠊提取物可以将 HepG2细胞阻滞在G2/M期，且呈现剂量依赖性，见图2。

图2 美洲大蠊提取物对HepG2细胞周期分布的影响（±s，n = 3）Fig. 2 Effects of Periplaneta americana extracts on cell cycle distribution of HepG2 cells（±s，n = 3）

2.4 美洲大蠊提取物对HepG2细胞的凋亡机制研究

Caspase抑制剂Z-VAD（Caspase Inhibitor Z-VAD）是一种泛Caspase抑制剂，其作用效果为抑制由Caspase激活导致的细胞凋亡，可用于观察特定的细胞凋亡是否通过Caspase激活来介导。使用坏死性凋亡抑制剂Nec-1和泛Caspase抑制剂Z-VAD共同孵育发现，加入坏死性凋亡抑制剂后，HepG2细胞存活率没有显著改变，加入Z-VAD后，存活率有明显提升（P＜0.001），说明美洲大蠊提取物诱导HepG2的死亡依赖于Caspase途径，见图3。

图3 美洲大蠊提取物对HepG2细胞的凋亡机制研究（±s，n = 3）Fig. 3 Study on the apoptosis mechanism of Periplaneta americana extracts on HepG2 cells（±s，n = 3）

2.5 美洲大蠊提取物对HepG2细胞的凋亡机制Caspase途径研究

Caspase 家族属于半胱氨酸蛋白酶，通常以酶原形式存在，是由两大、两小亚基两两组成的异四聚体，主要负责选择性地切割某些蛋白质，从而造成细胞凋亡。一旦信号转导途径被激活，Caspase则被活化，随后发生凋亡蛋白酶的级联反应。Caspase包括启动Caspase（Caspase-8、Caspase-9、Caspase10）和执行Caspase（Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7）两类。发挥作用时，在接收促凋亡刺激信号时启动Caspase裂解激活执行Caspase，被激活的执行Caspase最后使Caspase靶蛋白水解而引起细胞程序性死亡[15]。

通过Western Blotting实验表明，美洲大蠊提取物可以激活程序凋亡启动子Caspase 9，进而激活程序凋亡执行子Caspase 3。PARP（聚腺苷二磷酸核糖聚合酶）是Caspase的切割底物，最终表现为Cleaved PARP增加，意味着通过线粒体Caspase途径诱导人肝癌细胞凋亡，见图4。此结果与凋亡机制研究及流式细胞术结果一致，提示美洲大蠊提取物对HepG2的凋亡诱导作用确实是依赖于Caspase依赖的程序性凋亡途径。

图4 美洲大蠊提取物对HepG2细胞凋亡相关蛋白表达的影响（±s，n = 3）Fig. 4 Effects of Periplaneta americana extracts on expression of apoptosis-related proteins in HepG2 cells（±s，n = 3）

2.6 美洲大蠊提取物对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用

体外实验证明美洲大蠊提取物有一定的抗肝癌活性，为进一步检测其在体内抗肝癌活性，建立HepG2 异种移植裸鼠模型，并通过灌胃方式给药。美洲大蠊提取物中、高剂量组显示出有效的抗肿瘤效应，它明显降低了肿瘤的质量（P＜0.05），见表2。与对照组相比，给药组裸鼠的体质量差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。说明美洲大蠊提取物对小鼠没有明显的毒性。为了研究美洲大蠊提取物对肿瘤组织的影响，对肿瘤组织进行苏木精-伊红染色和免疫组化分析。与对照组相比，美洲大蠊提取物给药组（200 mg/kg）肿瘤组织出现坏死。免疫组化结果显示，美洲大蠊提取物能够诱导肿瘤细胞凋亡，见图5。

表2 美洲大蠊提取物对HepG2 荷瘤小鼠肿瘤的作用（±s，n = 6）Tab. 2 The effect of Periplaneta americana extracts on HepG2 tumorbearing mice（±s， n = 6）

注：与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

组别剂量/（mg/kg）瘤重/g 抑瘤率/%对照组 0 0.67±0.13 0索拉菲尼组 25 0.23±0.07*** 65.67±6.02***美洲大蠊提取物低剂量组50 0.57±0.09 14.93±4.14美洲大蠊提取物中剂量组100 0.48±0.13* 28.36±5.81*美洲大蠊提取物高剂量组200 0.36±0.09*** 46.27±4.58***F 17.04 14.66 P 0.000 0.000

表3 美洲大蠊提取物对HepG2 荷瘤小鼠体质量的影响（±s，n = 6）Tab. 3 The effect of Periplaneta americana extracts on body weight of HepG2 tumor-bearing mice（±s，n = 6）

组别剂量/（mg/kg）实验前体质量/g实验后体质量/g体质量增长率/%对照组 0 19.90±0.37 21.90±0.99 10.05±1.52索拉菲尼组 25 19.30±0.23 21.00±2.15 8.81±1.75美洲大蠊提取物低剂量组50 19.00±1.05 21.90±1.70 15.26±0.87美洲大蠊提取物中剂量组100 20.03±0.82 22.97±1.51 14.68±1.78美洲大蠊提取物高剂量组200 20.30±0.39 22.60±1.96 11.33±2.01 F 128.36 43.71 88.91 P 0.599 0.295 0.383

图5 H＆E染色及美洲大蠊提取物对HepG2荷瘤裸鼠肿瘤组织蛋白表达的影响（200×）Fig. 5 H＆E staining and effects of Periplaneta americana extract on protein expression in tumor tissues of HepG2 tumor-bearing nude mice（200×）

3 讨论

研究证实美洲大蠊提取物可通过线粒体途径诱导人肝癌细胞Bel-7402凋亡[17]。细胞凋亡作用在许多其它类型的癌症中实现有前景的抗癌作用，因此研究细胞凋亡机制是抑制肿瘤发展和有效治疗的重要策略[18]。本实验发现，美洲大蠊提取物对HepG2肝癌细胞具有明显的增殖抑制作用，还可诱导HepG2细胞凋亡。真核生物有规律的细胞周期，可分为G1、S、G2和M期。研究还发现，美洲大蠊提取物可使G2/M期细胞聚集，从而破坏了HepG2细胞的规律细胞分裂周期，因此美洲大蠊提取物可以引起HepG2细胞G2/M期阻滞。

细胞凋亡与细胞坏死有明显区别。使用坏死性凋亡抑制剂Nec-1和泛Caspase抑制剂Z-VAD共同孵育发现，加入坏死性凋亡抑制剂后，HepG2存活率没有明显改变，而加入泛Caspase抑制剂Z-VAD后，存活率有了明显提升，说明美洲大蠊提取物诱导HepG2的死亡至少部分是依赖于Caspase途径的。Caspase导致的细胞凋亡主要分为外在死亡受体途径和内在线粒体途径[19]。有研究发现，被激活的Caspase3是线粒体凋亡途径与死亡受体途径的交汇点，其作用是在凋亡启动时剪切其底物PARP，引起级联反应，细胞发生凋亡，剪切后变构的PARP又可激发其它Caspase家族蛋白水解[20]。免疫印迹实验显示，美洲大蠊提取物可以激活程序凋亡启动子Caspase 9，进而激活程序凋亡执行子Caspase 3，最终表现为Cleaved PARP增加，意味着细胞凋亡增加。表明美洲大蠊提取物可能是通过Caspase途径诱导细胞凋亡，动物免疫组化实验也证实了这一点。

4 结论

美洲大蠊提取物能够有效抑制HepG2肝癌细胞增殖，诱导HepG2细胞凋亡，使细胞发生G2/M期阻滞，通过激活程序凋亡启动子Caspase 9，进而激活程序凋亡执行子Caspase 3，诱导细胞凋亡。因此美洲大蠊提取物通过介导内在线粒体途径诱导细胞凋亡，而外源性途径是否参与凋亡，还需进一步进行相应研究。体内实验表明，美洲大蠊提取物能够明显抑制荷瘤小鼠肿瘤生长，且对器官没有明显毒性。因此，美洲大蠊提取物在体内外均可抑制肝癌HepG2细胞增殖，对其抗肝癌机制进行了初步研究，仍需全面深入探索，以对其临床广泛应用提供依据。