云南低纬高原甘蔗梢腐病菌检测鉴定及系统进化分析

王晓燕，仓晓燕，李文凤，李 婕，李银煳，单红丽，张荣跃，卢文洁，黄应昆

(1. 云南省农业科学院甘蔗研究所/云南省甘蔗遗传改良重点实验室，云南 开远 661699；2. 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，昆明 650205)

【研究意义】梢腐病是一种重要的世界性甘蔗真菌病害[1-3]。据报道，在印度该病的病株率为51.4%，甘蔗减产24.9%，每年造成250亿卢比的损失[4-5]。自20世纪80年代以来，中国所有甘蔗种植区都发生了梢腐病[6-7]。2000年来，因感病品种ROC 1、ROC 10、ROC 16、ROC 22、ROC 25和粤糖93-159的大规模推广，梢腐病频发且态势日趋严重[3]。近年因多雨高湿和感病品种粤糖93-159、ROC 25、ROC 1和川糖79-15的大面积种植，梢腐病在云南省临沧市、普洱市、玉溪市和红河州等地暴发，严重减产减糖[8]。据调查，严重发病时，病株率均值为81.1%，最高为100%；实测甘蔗产量平均损失38.42%，最高为48.5%；甘蔗糖分降低均值为3.14%，最高为4.21%[9]。为实现低纬高原云南蔗区甘蔗梢腐病的抗病育种和精准科学防控，有必要对该病的病原菌种类、优势种和系统进化关系等进行综合研究。【前人研究进展】镰刀菌复合种(Fusariumsp.)是甘蔗梢腐病的病原菌[10]。能够引起梢腐病的镰刀菌种类繁多，目前已报道的有7种，分别为F.andiyazi(Fa)、F.incarnatum(Fi)、F.oxysporum(Fo)、F.verticillioides(Fv)、F.proliferarum(Fp)、F.sacchari(Fsa)和F.subglutinans(Fsu)[11-13]。不同国家梢腐病病原菌种群及优势种不同。马来西亚的梢腐病病原菌是Fp、Fsa和Fsu，优势种是Fsa[14]；伊朗是Fv、Fp和Fsu，优势种是Fv[11-12]；南非是Fa、Fp和Fsa，优势种是Fsa[15]；菲律宾是Fsa、 Fp、 Fi、Fv和Fsu，优势种是Fsa[13]；中国已确定能引起甘蔗梢腐病的病原菌有Fsa、Fv、Fp和Fo，优势种为Fv[16-18]。【本研究切入点】云南省作为中国第二大蔗区，主要分布在以滇西为主的亚热带湿润多光照蔗区和滇南为主的亚热带半湿润蔗区[19]，近年来因气候异常，甘蔗梢腐病暴发成灾趋势明显，蔗茎大量枯死，已是减产减糖最严重的第一大病害。在病原研究的基础上种植和培育抗病品种是防控梢腐病最经济有效的措施，但有关云南蔗区梢腐病病原菌种类、优势种及其病菌间的系统进化等方面研究较少，导致有效防控缺乏可靠依据。【拟解决的关键问题】通过对采自云南不同蔗区的梢腐病样品进行病原菌PCR检测，以期明确该区域梢腐病的主要病原菌和优势种，为选育甘蔗梢腐病抗病品种和病害精准防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

2020年对云南省耿马县,孟连县，新平县，澜沧县勐朗镇勐滨村、上允镇，开远市和弥勒市等低纬高原不同蔗区灾害性病虫发生危害进行调查，从12个严重发病的甘蔗品种上采集了14份具典型梢腐病症状的样品，观察并记录病害症状(表1)。

1.2 甘蔗梢腐病优势种的PCR检测鉴定

1.2.1 引物设计与合成 根据参考文献报道的F.verticillioides(Fv-F4/Fv-R4)和F.proliferatum(Fp-F3/Fp-R3)特异性引物[20]对甘蔗梢腐病病原菌进行PCR检测，预期目的片段大小为400 bp。

1.2.2 总DNA的提取 取病叶0.1 g，按照真菌基因组DNA提取试剂盒(上海生物工程股份有限公司生产)的说明书提取病叶总DNA。

1.2.3 PCR检测 25 μL PCR反应体系中含DNA模板 2 μL、TaqPCR Master Mix 12.5 μL、上下游引物各2.5 μL(10 μmol/L)，灭菌ddH2O 5.5 μL。PCR反应条件为95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，63 ℃ 15 s，72 ℃30 s，30个循环；最后72 ℃10 min。

1.2.4 PCR产物克隆、测序及序列分析 利用琼脂糖凝胶回收试剂盒(北京天根生化科技有限公司生产)回收目的片段，并将其与pEASY-T5(北京全式金生物技术有限公司生产)进行连接转化，并把阳性克隆送重庆华大基因测序。在Genbank中对所得序列进行Blast检索和同源性分析。

1.3 数据统计与分析

从GenBank中下载已有甘蔗梢腐病病原菌的rDNA-ITS序列，用MEGA 6.0软件[21]构建Neighbor-Joining系统进化树，建树模式为Kimura 2-parameter，

自举检测(bootstrap)重复1000 次，甘蔗黑穗病病原菌(GenBank登录号：EF185083)为外群。

2 结果与分析

2.1 甘蔗梢腐病病害症状

14份病样具有典型的甘蔗梢腐病症状特征，表现为甘蔗叶片畸形扭曲缠结，变色，病斑上有红褐色条纹，楔形纵裂形似阶梯(图1)。

A: 叶片变形扭曲；B: 红褐色条纹、变色和阶梯状叶片A: Deformed and twisted leaf; B: Reddish-brown stripes, discolored, and stepped leaves图1 甘蔗梢腐病田间典型症状Fig.1 Typical field symptoms of sugarcane pokkah boeng

2.2 病原菌分子鉴定结果

14份甘蔗梢腐病样品中有12份都扩增出大小约400 bp的目的条带(图2)，表明12份样品均检测到Fv和Fp。选取7份混合侵染样品的PCR产物进行测序，所得序列提交GenBank。用BLAST在GenBank中搜索同源序列，结果表明，7份混合侵染样品的Fv(GenBank登录号：MZ126549～MZ126555)和Fp(GenBank登录号：MZ102259～MZ102265)序列分别与GenBank数据库中Fv菌株20(GenBank登录号：KU508286)和Fp德宏菌株(GenBank登录号：KJ629482)的一致性为98.6%～100%和100%，明确Fv和Fp是低纬高原云南蔗区梢腐病的病原菌，且存在混合侵染现象(表1)。

A：Fv的PCR扩增结果；B： Fp的PCR扩增结果；1～7: 样品KY1, KY2, KY3, ML1, ML2, ML3 和 ML4; Pc: Fv DNA (A)，Fp DNA (B); Nc: 甘蔗黑穗病菌DNA; CK: ddH2OA: The PCR amplification result of Fv; B: The PCR amplification result of Fp; 1-7: Samples of KY1, KY2, KY3, ML1, ML2, ML3 and ML4; Pc：Fv DNA(A)，Fp DNA(B)；Nc: DNA from sugarcane smut pathogen;CK:ddH2O图2 部分甘蔗梢腐病样品PCR扩增结果Fig.2 PCR amplification result of some sugarcane pokkah boeng samples

表1 14份甘蔗梢腐病样品病原菌鉴定结果

续表1 Continued table 1

2.3 系统进化分析

系统进化树中云南蔗区梢腐病病原菌主要分成两组，即Fv组和Fp组。除来自云南澜沧ROC 25和云南弥勒福农10-1405上的Fv单独聚为一个小组外，在Fv组中，5个混合侵染样品与不同地理来源Fv菌株聚为一组，并与Fo(广西菌株)有较近的亲缘关系。就Fp而言，本研究获得的Fp序列与不同地理来源Fp菌株聚为一组(图3)。

图3 甘蔗梢腐病菌ITS序列系统进化分析Fig.3 Phylogenetic analyses of sugarcane pokkah boeng isolates based on rDNA-ITS sequences

3 讨 论

甘蔗梢腐病是一种重要的真菌病害，发生在甘蔗的整个生长期。感病后，甘蔗叶片褪绿黄化、缩皱扭曲，最终导致甘蔗停止生长或梢部腐烂，从而影响甘蔗产量形成和糖分积累[22]。部分感病品种的发病率高达80%以上，给甘蔗生产造成巨大损失，该病严重制约蔗糖产业可持续高质量发展[23-25]。目前，对甘蔗梢腐病的研究主要集中在病原菌分离鉴定、病原菌生物学特性和抗性评价等方面[26]，并报道了多个镰刀菌能引起梢腐病的发生，且蔗区不同种群及优势种也不同[11-18]。云南是中国第二大蔗区，近年来由于多雨高湿和感病品种大面积种植，云南蔗区暴发梢腐病，为科学精准防控该病，保障蔗糖产业的高质量发展，本研究对采自云南不同蔗区的梢腐病样品进行PCR检测鉴定，初步确定低纬高原云南蔗区的梢腐病病原菌为Fv和Fp。

2014年Lin等[16]对采自福建、广东、广西、云南和海南的不同甘蔗梢腐病进行病原菌鉴定和系统进化分析，确定引起甘蔗梢腐病的病原菌有Fv和Fp。Fv占菌株总数的93%，为优势种，一般在高温高湿的条件下发生严重；Fp占菌株总数的7%，耐低温，致病性较弱，一般在冬季危害。虽然本研究中云南甘蔗梢腐病的病原菌也是Fv和Fp，但14份梢腐病样品中就有12份均检测出2种病原菌，混合侵染现象普遍存在，表明单株中多种病原菌共存是梢腐病病原菌研究中不可回避的事实，有必要对这种共存模式形成的机制及其在侵染致病中的作用做进一步研究。

系统进化分析中，Fv和Fp 2种梢腐病病原菌无明显品种和地理差异性，然而来自低纬高原云南蔗区的Fv不同菌株分布于不同的分支上，说明云南Fv菌株间存在广泛的遗传多样性，同时也表明低纬高原云南蔗区可能是中国Fv多样性分布的一个核心区域。

4 结 论

本研究采用分子鉴定方法，通过对云南省耿马县，孟连县，新平县，澜沧县勐朗镇勐滨村、上允镇，开远市和弥勒市等蔗区采集到的14份甘蔗梢腐病病原菌进行检测和序列分析，初步确认Fv和Fp是低纬高原云南蔗区梢腐病的病原菌，混合侵染现象普遍存在，为进一步研究甘蔗梢腐病及其科学防控奠定了基础。